Methods for Sequencing the Mitochondrial DNA A+T-Rich Region of Cochliomyia Macellaria(Diptera: Calliphoridae) from North America

ABSTRACT

The A+T-rich region (ATRR) is the major non-coding segment of insect mitochondrial DNA (mtDNA). It is a hypervariable locus, and therefore useful for population genetic studies. Forensic entomologists could potentially use the ATRR to test for regional subpopulations of a carrion insect species, or to reconstruct the postmortem movement of a corpse. However, the ATRR presents greater genotyping difficulties compared to the commonly studied mtDNA coding regions. Homomeric stretches and length heteroplasmy within the ATRR, and a lack of conserved internal PCR primers, so that PCR amplicons of around 1500 bp are necessary, make both direct sequencing and sequencing of cloned product difficult. We designed ATRR internal primers, complementary to the same annealing site, and tested them using C. macellarla specimens from Puerto Rico, Florida, Tennessee, and West Virginia. The entire ATRR sequence, other than the primer site, could be obtained from cloned PCR product. The ability to use shorter PCR amplicons should also make this method more suitable for analyzing degraded evidence.

RÉSUMÉ

Une région AT-rich (ATRR) est un segment majeur de non-codification d'insecte mitochondrial ADN (mtDNA). Une région est un lieu géométrique hypervariable et utile pour les études génétiques d'une population. Les entomologistes légaux pourraient potentiellement utiliser l'ATRR pour évaluer les sous-populations régionales d'une espèce d'insecte charogne, ou reconstruire le mouvement rétrospectif d'un cadavre. Néamoins, l'ATRR présente de plus grandes difficultés génotype comparativement au mtDNA codage régional qui est généralement étudié. Les étandues homomeric, les longueures heteroplasmy dans l'ATRR et le manque d'abécédaires PCR intérieurs conservés pour qu'un PCR amplicons d'environ 1500 bp soient nécessaires, rend les séquences directes et les séquences de produit de clonage difficile. Nous avons conçu des abécédaires intérieurs ATRR complémentaires au même site recuisant et les avons évalués utilisant C. macellaria les exemplaires de Porto Rico, la Floride, le Tennessee et la Virginie Occidentale. La séquence ATRR en entier, autre que le site d'abécédaire de base, pourrait être obtenu du produit PCR cloné. La capacité d'utiliser de plus petits PCR amplicons devrait aussi rendre cette méthode plus convenable pour l'analyse des évidences dégenérées.