Comparison of in vivo and in vitro methods for pathogenicity evaluation for mycoplasma gallisepticum in respiratory infection

Summary

This study was designated to examine the pathogenicity of several strains of Mycoplasma gallisepticum (R, F, S‐6, 227 and A5969) and laboratory derived substrains. Preliminary results indicated that the nine M. gallisepticum strains differed markedly in their pathogenicity for chickens. A comparison was made between various in vivo and in vitro methods for quantitative evaluation of pathogenicity. Reproducibility, convenience, and relevance to clinical observations were considered.

Two in vivo tests were employed. In one case 2‐week‐old chickens were infected with M. gallisepticum by aerosol. Air sac lesion score, ability to reisolate M. gallisepticum from trachea and air sac, and serological response to M. gallisepticum were determined 2 weeks post infection. The second test was based on the ability to reisolate M. gallisepticum 3 days after intratracheal inoculation at different dose levels. In this way it was possible to calculate a median trachéal infection dose for each of the strains tested, a parameter which reflected their ability to colonise this organ. Scanning electron microscopy (SEM) was used to examine changes in the surface morphology of the infected trachea and photometric analysis of the SEM lesion was performed. Certain strains multiplied profusely in the trachea of healthy birds without causing detectable pathological changes.

Chick trachéal ring (TR) cultures were used for estimating pathogenicity in vitro. In the standardised TR system a method for quantitative evaluation of mycoplasma‐TR interaction was devised. The use of the TR system as a model for evaluating in vitro pathogenicity was rapid and less subject to environmental variation than the in vivo tests. The test was economical with respect to time, space and birds.

Resume

Cette étude a été entreprise pour étudier le pouvoir pathogène de différentes souches de Mycoplasma gallisepticum (Mg) (R, F, S‐6, 227 et A5969) ainsi que de souches dérivées de laboratoire. Les premiers résultats indiquent que neuf souches de M. gallisepticum (Mg) diffèrent de manière nette en ce qui concerne leur pouvoir pathogène pour le poulet. Une comparaison a été faite entre les différentes méthodes in vivo et in vitro d'évaluation de la pathogénicité. La repro‐ductibilité, la commodité et la corrélation avec les observations cliniques ont été prises en considération. Deux tests in vivo ont été employés. Dans un cas des poulets âgés de deux semaines ont été infectés avec un aérosol de M. gallisepticum. La notation des lésions des sacs aériens, la possibilité de réisoler M. gallisepticum de la trachée et des sacs aériens ainsi que la réponse sérologique à cet agent ont été déterminées deux semaines après l'infection. Le deuxième test a été basé sur la possibilité de réisoler M. gallisepticum trois jours après l'inoculation intra trachéale effectuée à différentes doses. De cette manière il a pu être calculé des doses infectieuses trachéales médianes pour chacune des souches testées, paramètre qui reflétait leur aptitude à coloniser cet organe. L'examen en microscopie électronique à balayage a été pratiqué pour étudier les modifications de la morphologie de la surface des trachées infectées et une analyse photométrique des lésions a été réalisée. Certaines souches se sont multipliées abondamment dans la trachée des oiseaux sains sans entraîner de modifications pathologiques décelables.

Les cultures d'anneaux de trachée (TR) ont été utilisées pour estimer le pouvoir pathogène in vitro. Avec le système TR standardisé, une méthode d'évaluation quantitative de l'interaction mycoplasma‐TR a été définie. L'emploi des TR comme modèle d'évaluation du pouvoir pathogène in vitro a été rapide et moins sujet aux variations de l'environnement que les tests in vivo. Cette technique s'est révélée économique en prenant en considération le temps, l'espace et les oiseaux nécessaires.

Zusammenfassung

Durch die Untersuchung sollte die Pathogenität verschiedener Mycoplasma gallisepticum (Mg)‐Stämme (R, S‐6, 227 und A5969) und von Laboratoriumssub‐stämmen geprüft werden. Frühere Ergebnisse sprachen für deutliche Pathogenität‐sunterschiede der neun M. gallisepticum stämme für Hühner. Verschiedene in vivo und in vitro Methoden für die quantitative Pathogenitätsbewertung wurden verglichen. Dabei wurde die Reproduzierbarkeit, Durchführbarkeit und Relevanz zu klinischen Beobachtungen berücksichtigt.

Zwei in vivo‐Tests wurden angewandt. In einem Fall wurden 2 Wochen alte Küken mit M.gallisepticum per Aerosol infiziert. Die Menge der Luftsackveränderungen, das Gelingen der Rückisolierung von M. gallisepticum aus Trachea und Luftsack und die serologische Reaktion auf M. gallisepticum wurden 2 Wochen post infec‐tionem bestimmt. Der zweite Test basierte auf dem Erfolg der Rückisolierung von M. gallisepticum 3 Tage nach der intra‐trachealen Inokulation von verschiedenen Dosen. Auf diese Weise gelang es eine mittlere tracheale Infektionsdosis für jeden getesteten Stamm zu kalkulieren, ein Parameter, welcher die Fähigkeit eines Stammes dieses Organ zu besiedeln, reflektiert. Das Rasterelektronenmikroskop (SEM) wurde benutzt, um die Veränderungen der Oberflächenmorphologie der infizierten Trachea zu beurteilen. Eine photometrische Analyse der SEM Veränderungen wurde durchgeführt. Bestimmte Stämme vermehren sich üppig in der Trachea gesunder Tiere, ohne erkennbare pathologische Veränderungen zu verursachen.

Für die in vitro Pathogenitätsprüfung wurden Kükentracheakingkulturen (TR) verwendet. Es wurde eine standardisierte TR‐system‐methode für die quantitative Beurteilung der Mycoplasma‐TR‐Wechselwirkung aufgebaut. Der Gebrauch des TR‐System als ein Modell für die in vitro Pathogenitätsbeurteilung führt zu schnellen Ergebnissen und unterliegt weniger Umweltschwankungen, als die in vivo Teste. Der Test arbeitet ökonomisch in Bezug auf Zeit, Platz und Tierzahl.

Resumen

Este estudio fué desiñado con el objeto de examinar el grado de patogenicidad de varias cepas de Mycoplasma gallisepticum (R, F, S‐6, 227 y A5969) y sus substratos derivados en al laboratorio. Los resultados preliminares indican que nueve cepas de M. Gallisepticum difirieron marcadamente en su patogenicidad para el pollo. Se hizo una comparación entre varios metodós in vivo e in vitro para evaluar cuantita‐tivemente la patogenicidad. Se comentan la reproductibilidad, conveniencia y relevancia de las observaciones clínicas.

Se emplearon dos pruebas in vivo. En un caso se infectaron pollos de 2 semanas de edad con M. Gallisepticum por medio de aérosoles. La escala de lesiones en sacos aereos, la habilidad para reaislar al M. Gallisepticum a partir de la traquea y de los sacos aéreos y la respuesta serologica a M. Gallisepticum Fueron determinadas 2 semanas después de la inoculacion intratraqueal a diferentes dosis.

De esta manera fué posible calcular la dosis promedio de infección traqueal para cada una de las cepas estudiadas, un parametro que reflejo su habilidad para colonizar al organo. Microscopía electronicá de barnido (MEB) fué empleada para ex‐maniar los canbios morfologicos en la superficie de las traqueas infectadas ademas de haberse llevado a cabo un analisis fotometrico de las lesiones por medio de la MEB. Ciertas cepas se multiplicaron profusamente en la traquea de aves sanas sin provocar cambios patologicos detectables.

Se emplearon cultivos de anillo traqueal (AT) para estimar la patogenicidad in vitro. Al hacer la estandarizacion del sistema de at, se logro establecer un metodo para la evaluacion cuantitativa de la interaccion mycoplasma‐AT. El uso del sistema at como modelo para la evaluacion de la patogenicidad in vitro fué rapida y menos sujeta a variacion ambiental que las pruebas in vivo. La prueba fué económica con respecto al tiempo, espacio y a las aves.