Detection of turkey rhinotracheitis virus in turkeys using the polymerase chain reaction

Summary

Six‐week‐old turkey poults were infected with the virulent UK/3B/85 strain of TRTV. Tracheal and oesophageal swabs were made every 2 to 3 days from groups of five poults and the RNA extracted. The TRTV RNA was then reverse‐transcribed into complementary DNA (cDNA) using an oligonucleotide complementary to the 3’ end of the fusion protein (F) mRNA. The cDNA was then used in a polymerase chain reaction (PCR) with an upstream primer to generate a product of approximately 0.5 kbp which was detected by ethidium bromide staining after electrophoresis. In this way, TRTV was detected in both types of swab for 17 to 19 days post‐infection, nearly 2 weeks after the peak titres of infectious virus. Swabs which were allowed to dry completely before RNA extraction were as successful as swabs kept wet and extracted almost immediately, useful for when samples are collected in the field. The oligonucleotides amplified the 0.5 kbp product from TRTV strains isolated in six countries over a 13‐year period, indicating that they might be usable as ‘universal’ oligonucleotides for TRTV detection.

Resume

Des dindes âgées de 6 semaines ont été infectées avec la souche virulente UK/3B/85 de virus de la rhinotrachéite de la dinde (TRTV). Les écouvillonnages de trachée et d'oesophage ont été réalisés tous les 2–3 jours à partir de groupes de 5 dindes et l'ARN a été extrait. L'ARN TRTV a été ensuite réverse transcrit en ADN complémentaire (cDNA) en utilisant un oligonucléotide complémentaire au 3’ terminal de la protéine de fusion (F) mRNA. Le cDNA a été utilisé dans une réaction d'amplification génique (PCR) avec une amorce générant une production d'approximativement 0,5 kbp, mise en évidence par coloration au bromure d'éthidium après électrophorèse. De cette manière, le TRTV a été décelé dans les deux types d'écouvillonnages pendant 17 à 19 jours après infection, soit environ deux semaines après les pics des titres infectieux du virus. Les écouvillons soumis à dessication avant extraction de l'ARN ont donné les mêmes résultats que ceux maintenus humides avec extraction pratiquement immédiate, ce qui présente un intérêt lorsque les échantillons sont collectés sur le terrain. Les oligonucléotides amplifiés à 0,5 kbp produits à partir des souches de TRTV isolées dans six pays pendant une période de 13 ans montrent qu'ils peuvent être utilisés comme oligonucléotides “universels” pour la détection du TRTV.

Zusammenfassung

Sechs Wochen alte Putenküken wurden mit dem virulenten Stamm UK/3B/85 des Puten‐Rhinotracheitisvirus (TRTV) infiziert. Alle 2 bis 3 Tage wurden aus Gruppen von fünf Küken Trachea‐und Ösophagusabstriche gemacht und die DNS extrahiert. Die TRTV‐DNS wurde dann mit einem für das 3'‐Ende der Fusionsprotein (F)‐mRNS komplementären Oligonuk‐leotid in komplementäre DNS (cDNS) revers transkribiert. Die cDNS wurde dann in einer Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) mit einem upstream Primer verwendet, um ein Produkt von etwa 0,5 kbp zu erzeugen, das nach der Elektrophorese durch Ethidiumbrornid‐Färbung nachgewiesen wurde. Auf diese Weise wurde TRTV in Abstrichen beider Arten nach der Infektion 17 bis 19 Tage lang, fast 2 Wochen nach den maximalen Titern von infektiösem Virus, nachgewiesen. Abstriche, die man vor der Extraktion vollständig trocknen ließ, waren ebenso erfolgreich wie feucht gehaltene und fast sofort extrahierte Abstriche; das ist günstig, wenn Proben in der Praxis gesammelt werden. Die Oligonukleotide amplifizierten das 0,5 kbp‐Produkt von TRTV‐Stämmen, die in sechs Ländern im Laufe von 13 Jahren isoliert wurden, was darauf hindeutet, daß sie als “universelle” Oligonukleotide für den TRTV‐Nach‐weis brauchbar sein könnten.

Resumen

Se infectaron pavipollos de seis semanas de edad con la cepa virulenta UK/3B/85 de TRTV.

Se recogieron hisopos esofágicos y traqueales cada dos o tres días de diversos grupos formados por 5 pavipollos y se extrajo el ARN de las muestras. El ARN del TRTV se transcribió posteriormente a ADN (ADNc) empleando un oligonucleótido complementario para el extremo 3’ del ARNm de la proteína de fusión (F). El ADNc se utilizó para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un “upstream primer” para dar lugar a un producto de aproximadamente 0.5 kbp que fue detectado mediante bromuro de etidio tras una electrofore‐sis. De esta manera se demostró TRTV en los dos tipos de hisopos durante 17 a 19 días tras la infección, casi dos semanas después de que se alcanzaran los títulos maximos de virus infeccioso. Los hisopos que se secaron completamente antes de la extracción del ARN fueron tan adecuados como aquellos mantenidos húmedos y extraidos casi inmediatamente, demostrando su utilidad cuando las muestras se toman en condiciones de campo. Los oligonucleótidos amplificaron el producto de 0.5 kbp de las cepas de TRTV aisladas en seis paises durante un periodo de 13 años, indicando que podrían ser utilizados como oligonucleótidos ‘universales’ para la detección de TRTV.

Notes

Li Jing sadly died in October, 1992.

Present Address: Intervet UK, The Elms, Thicket Road, Houghton, Huntingdon, Cambridgeshire PE17 2BQ, UK.