Replication of non‐defective reticuloendotheliosis viruses in the avian embryo assayed by PCR and immunofluorescence

Summary

Congenital transmission of reticuloendotheliosis virus (REV) is known to occur when one of the parents in either tolerantly infected or viraemic; however little attention has been paid to replication of the virus within the embryo itself. In this study five non‐defective and one replication‐defective strain of REV were inoculated into the yolk sac of 6‐day‐old embryonated eggs. With the exception of one non‐defective strain, the others induced embryonic deformation or lesions that were apparent on the day of hatching. Replicative integration of the provirus was determined for several tissues of each embryo by the polymerase chain reaction employing a set of primers specific for the long terminal repeat. Indirect immunofluorescent detection of whole virus was performed on the same tissues in parallel. A variation in replication was found among the strains and between embryos inoculated with the same strain of virus, therefore, the results for each virus strain were expressed as cumulative values. The liver and spleen were the most commonly affected organs, while the bursa of Fabricius and thymus supported viral replication to a lesser degree. Detection of proviral DNA in blood was evidence that the chicks had been congenitally infected. Such an infection would likely lead to tolerance. Isolates REV‐S and REV‐D were found to replicate to the highest extent, and they also caused lesions in the commercial type of embryonated eggs, while REV‐S and mainly the REV‐T prototype were pathogenic for the SPF embryonated eggs.

Résumé

La transmission verticale du virus de la réticuloendotheliose (REV) est bien connue et intervient quand un des parents est infecté latent ou est virémique, mais la multiplication du virus au niveau même de l'embryon a été peu étudiée. Dans cet essai, cinq souches de REV non défectives et une défective ont été inoculées dans le vitellus d'oeufs embryonnés de 6 jours. A l'exception de la souche non défective, les autres ont induit des déformations ou des lésions de l'embryon qui étaient apparentes le jour de l'éclosion. L'intégration de la forme réplicative du provirus a été étudiée dans différents tissus de chaque embryon par la réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant un couple d'amorce spécifique de la séquence terminale répétée. La mise en évidence du virus complet a été effectuée, en parallèle à partir des mêmes tissus, et à l'aide d'une technique d'immunofluorescence indirecte. Des variations concernant la multiplication ont été observées entre les souches ainsi qu'entre les embryons inoculés avec la même souche virale. Aussi des résultats ont‐ils été exprimés en valeurs cumulées pour chaque souche virale. Le foie et la rate ont été les organes les plus fréquemment affectés, alors que la multiplication virale s'est réalisée à des degrés moindres dans la bourse de Fabricius et le thymus. La détection de l'ADN proviral dans le sang est la preuve que les poussins ont été infectés verticalement. Une telle infection pourrait conduire probablement à une tolérance. Il a été mis en évidence que des isolats REV‐S et REV‐D étaient été capables de se multiplier aux taux les plus élevés et d'entraîner ainsi des lésions dans les oeufs embryonnés de types commerciaux, alors que les prototypes REV‐S et principalement REV‐T étaient pathogènes pour les oeufs embryonnés EOPS.

Zusammenfassung

Von der kongenitalen Übertragung des Retikuloendotheliosevirus (REV) ist bekannt, daß sie vorkommt, wenn einer der Elternteile entweder tolerant infiziert oder virämisch ist. Wenig Beachtung ist jedoch der Replikation des Virus im Embryo selbst geschenkt worden. In der vorliegenden Untersuchung wurden fünf nicht‐defekte Stämme und ein replikationsdefekter Stamm des REV in den Dottersack von 6 Tage alten embryonierten Eiern inokuliert. Mit der Ausnahme von einem nicht‐defekten Stamm verursachten die anderen Embryodeformitäten und Läsionen, die am Schlupftag offenbar wurden. Die Replikationsintegration des Provirus in verschiedenen Geweben aller Embryonen wurde mit der Polymerase‐Kettenreaktion bestimmt, wobei ein für das “long terminal repeat” spezifisches Set von Primern verwendet wurde. Parallel dazu wurde vermittels indirekter Immunfluoreszenz der Nachweis von komplettem Virus in denselben Geweben durchgeführt. Bei der Replikation wurde eine Variation unter den Stämmen festgestellt und zwischen Embryonen, die mit dem gleichen Virusstamm inokuliert waren, und deshalb wurden die Resultate für jeden Virusstamm als kumulative Werte ausgedrückt. Leber und Milz waren die am häufigsten befallenen Organe, während Bursa Frabricii und Thymus für die Virusvermehrung weniger gut empfänglich waren. Der Nachweis von Provirus‐DNS im Blut war ein Beweis dafür, daß die Küken kongenital infiziert worden waren. Solch eine Infektion würde wahrscheinlich zur Toleranz führen. Es wurde festgestellt, daß sich die Isolate REV‐S und REV‐D im stärksten Ausmaß vermehrten, und ferner verursachten sie in embryonierten kommerziellen Eiern Läsionen, während REV‐S und hauptsächlich der Prototyp REV‐T für die embryonierten SPF‐Eier pathogen waren.

Resumen

La transmisión congénita del virus de la reticuloendoteliosis (REV) ocurre cuando uno de los padres tiene una infección tolerante o es virémico; no obstante se ha dado poca importancia a la replicación del virus dentro del propio embrión. En este estudio se utilizaron cinco cepas no defectivas y una de replicación defectiva de REV y fueron inoculadas en el saco vitelino de huevos embrionados de 6 días de edad. Todas las cepas a excepción de la cepa no defectiva indujeron deformidades o lesiones en el embrión que fueron aparentes el día de la eclosión. Se determinó la integración replicativa del provirus para varios tejidos de cada embrión mediante la reacción en cadena por la polimerasa empleando para ello un juego de ‘primers’ específico para la repetición terminal larga. Se realizó la detención de virus completo mediante inmunofluorescencia empleando los mismos tejidos en paralelo. Se encontró una variación en la replicación entre las cepas y entre los embriones inoculados con la misma cepa de virus por lo que los resultados para cada virus se expresaron como valores acumulativos. El hígado y el bazo fueron los órganos más frecuentemente afectados mientras que la bursa de Fabricio y el timo pertimieron la replicación viral en menor grado. La detecció de AND proviral en la sangre fue evidencia de que los pollitos habían sido infectados de forma congénita. Dicho tipo de infección daría lugar a tolerancia. Los aislamientos REV‐S y REV‐D replicaron a su grado máximo grado y produjeron lesiones en huevos embrionados de tipo comercial mientras que REV‐S y principalmente el prototipo REV‐T fueron patógenos para huevos embrionados SPF.