Implementation of loop-mediated isothermal amplification methods in lateral flow devices for the detection of Rhizoctonia solani

Abstract

Rhizoctonia solani causes destructive diseases in many crops throughout the world, resulting in significant yield and quality losses. Early detection of R. solani would facilitate deployment of timely disease management strategies and prevention of spread of asymptomatic infected plant material. The aim of this study was to develop a simple, rapid and sensitive loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the detection of R. solani in plants and soil samples. LAMP primers, based on the internal transcribed spacer DNA sequence, were designed for detecting most anastomosis groups of R. solani. Using these primers, a LAMP protocol was developed, which in sensitivity tests was shown to detect very low levels of DNA of R. solani and R. zeae, but not R. oryzae. This LAMP protocol successfully detected R. solani on inoculated plant tissues and soil samples. For onsite application in the field, the LAMP protocol was implemented in a generic anti-biotin and anti-fluorescein antibody-based LFD. LAMP reactions were performed using biotin-labelled primers, which were hybridized with a fluorescein amidite (FAM)-labelled hybridization probe and detected with the LFD. This LAMP-LFD successfully detected R. solani in infected plant tissues. The LAMP-LFD procedure presented here is simple and rapid, and is comparable to quantitative real-time PCR. It has potential for onsite diagnosis of R. solani in infected plant samples, seeds, vegetative cuttings and soil samples.

Résumé

Rhizoctonia solani cause des maladies destructrices chez plusieurs plantes cultivées dans le monde entier, ce qui engendre d’importantes pertes de rendement et de qualité. La détection précoce de R. solani faciliterait le déploiement opportun de stratégies de gestion et la prévention de la dissémination de végétaux infectés asymptomatiques. Le but de cette étude était de développer une méthode d’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) simple, rapide et sensible pour détecter R. solani dans des échantillons de végétaux et de sol. Les amorces propres à LAMP, basées sur la séquence de l’espaceur transcrit interne de l’ADN, ont été conçues pour détecter la majorité des catégories d’anastomoses de R. solani. Un protocole LAMP a été développé à partir de ces amorces, qui, lors des tests de conformité, a permis de détecter de très faibles taux d’ADN de R. solani et de R. zeae, mais pas de R. oryzae. Ce protocole a permis de détecter R. solani avec succès sur des tissus végétaux inoculés et dans des échantillons de sol. En vue d’utilisations sur le terrain, le protocole a été appliqué conformément à un dispositif de flux latéral (LFD) générique fondé sur les anticorps anti-biotine et anti-fluorescéine. Les réactions LAMP ont été effectuées à l’aide d’amorces marquées à la biotine qui ont été hybridées avec une amorce d’hybridation marquée à l’amidite de fluorescéine (FAM) et détectée avec le LFD. La méthode LAMP-LFD a permis de détecter R. solani avec succès dans des tissus végétaux infectés. La méthode présentée dans cet article est simple et rapide et se compare à la PCR quantitative en temps réel. Elle permet d’identifier R. solani sur le terrain, dans des échantillons de végétaux infectés, des semences, des boutures, ainsi que dans des échantillons de sol.

Keywords:

• diagnostics
• LAMP
• lateral flow device
• PCR
• qRT-rhizoctonia
• PCR
• pathogen detection

Mots clés:

• LAMP
• Rhizoctonia
• diagnostics
• dispositif de flux latéral
• PCR
• qRT-PCR
• détection des agents pathogènes

Acknowledgements

We are grateful to Dr Norman for critically reading the manuscript. This work was supported by funds to G.S.A. from the Florida Agriculture Experiment Station of the Institute of Food and Agricultural Sciences at the University of Florida and Florida Nursery Growers and Landscape Association.