Using DIR1 to investigate long-distance signal movement during Systemic Acquired Resistance

Abstract

During Systemic Acquired Resistance (SAR), a SAR-inducing infection in one leaf initiates movement of phloem-mobile signals to uninfected distant leaves to prime plants to respond in a resistant manner to subsequent infections. Our early work with the dir1-1 (defective in induced resistance) mutant in Arabidopsis demonstrated that the DIR1 protein is required for SAR and led to the hypothesis that DIR1, a lipid transfer protein (LTP), moves to distant leaves to activate SAR. To prove this hypothesis, we monitored DIR1-GFP accumulation in phloem exudates using an estrogen-SAR assay. In this assay, estrogen treatment induces DIR1-GFP expression in one leaf of dir1-1, followed by SAR-induction in the same leaf. DIR1-GFP was detected in exudates collected from local and distant leaves of SAR-induced plants using both DIR1 and GFP antibodies. This provides compelling evidence that DIR1 moves via the phloem to distant leaves to initiate priming. Our work fills a major gap in research on SAR as no other putative SAR mobile signal has been shown to move in planta to distant leaves. To discover how DIR1 enters the phloem, we took advantage of plant lines with compromised cell-to-cell movement caused by overexpression of Plasmodesmata-Located Proteins. These lines were defective for SAR, and DIR1 was not observed in distant leaf phloem exudates, supporting the idea that cell-to-cell movement of DIR1 through plasmodesmata is important for SAR signal movement. To discover new phloem proteins that play a role during SAR, we compared phloem exudate proteomes collected from mock- and SAR-induced leaves using quantitative LC-MS/MS. Numerous proteins were enriched in SAR-induced versus mock-induced phloem exudates and T-DNA knock-out lines in some of these genes were SAR-defective, indicating they contribute to SAR. Identification of SAR-specific phloem proteins may provide clues as to the protein complement of a high molecular weight DIR1-containing complex found in phloem exudates only after SAR induction. We will take advantage of DIR1’s proteinaceous nature to identify proteins in the high molecular weight mobile signal complex, proteins associated with phloem loading of SAR signals and proteins involved in DIR1 perception in distant leaves.

Résumé

Dans le cadre du processus de résistance systémique acquise (RSA), une infection qui induit la RSA dans une feuille amorce l’envoi de signaux qui se propagent par le phloème pour atteindre les feuilles distantes et saines afin d’induire, chez les plants, une réaction de résistance aux infections subséquentes. Nos premiers travaux avec le mutant dir1-1 (déficient en résistance induite) chez Arabidopsis ont montré que la protéine DIR1 était requise pour induire la RSA et ont permis d’échafauder l’hypothèse que la DIR1, une protéine de transfert de lipide (PTL), se propage vers les feuilles distantes pour activer la RSA. Afin de confirmer cette hypothèse, nous avons suivi l’accumulation de DIR1-GFP dans les exsudats de phloème grâce à un biotest œstrogène-RSA. Au cours de ce biotest, le traitement avec œstrogène a induit l’expression de la DIR1-GFP dans une feuille du mutant dir1-1, suivie de l’induction de la RSA dans la même feuille. La DIR1-GFP a été détectée dans les exsudats collectés dans des feuilles voisines et distantes de plants chez lesquels la RSA avait été induite grâce aux anticorps de la DIR1 et de la GFP. Cela prouve irréfutablement que la DIR1 se propage par le phloème pour atteindre les feuilles distantes et stimuler l’amorce de la RSA. Nos travaux comblent une importante lacune quant à la recherche sur la RSA, puisqu’on n’avait jamais démontré qu’un signal putatif de la RSA se propageait in planta vers les feuilles distantes. Pour découvrir comment la DIR1 pénètre dans le phloème, nous nous sommes servis des lignées de plantes dont le mouvement de cellule à cellule est compromis par la surexpression de protéines situées dans les plasmodesmes. Ces lignées étaient déficientes sur le plan de la RSA et nous n’avons pas observé de DIR1 dans les exsudats du phloème des feuilles distantes, ce qui supporte l’idée que la propagation de DIR1 de cellule à cellule par les plasmodesmes est importante quant à la propagation du signal de la RSA. Afin de découvrir de nouvelles protéines du phloème qui jouent un rôle durant la RSA, nous avons comparé, grâce à une analyse quantitative par LC-MS/MS, les protéomes d’exsudats de phloème collectés sur des modèles de feuilles et des feuilles chez lesquelles la RSA avait été induite. De nombreuses protéines ont été enrichies dans les exsudats de phloème découlant de l’induction de la RSA, contrairement à ceux des modèles, et les lignées invalidées affichant des insertions d’ADN-T dans certains de ces gènes n’induisaient pas la RSA. Cela indique que ces protéines contribuent à la RSA. L’identification de protéines phloémiennes propres à la RSA peut fournir des indices quant au complément protéique d’un complexe de poids moléculaire élevé contenant la DIR1, trouvé dans les exsudats de phloème, seulement après induction de la RSA. Nous exploiterons la nature protéique de la DIR1 pour identifier les protéines du complexe de poids moléculaire élevé responsable de la propagation des signaux, protéines associées au chargement des signaux de la RSA dans le phloème ainsi que protéines impliquées dans la perception de la DIR1 dans les feuilles distantes.

Keywords:

• DIR1
• long-distance signalling
• phloem proteins
• plasmodesmata
• Systemic Acquired Resistance

Mots clés:

• DIR1
• plasmodesmes
• proté ines phloémiennes
• résistance systémique acquise
• signal à longue distance

Acknowledgements

We would like to thank Dr Deena Errampalli for bringing together the speakers for this symposium and the Canadian Phytopathological Society and Canadian Society of Plant Biology for the sponsoring this symposium as part of Botany 2015.

Additional information

Funding

This work was funded by NSERC Discovery, RTI and CFI Leadership grants to RKC and Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) grant to ACV, and an Ontario Graduate Scholarship to PC.