A duplex PCR method for identification of cultures of Fusarium graminearum from infected wheat grain without DNA extraction

Abstract

A simple and accurate PCR protocol for identification of Fusarium graminearum from fungal cultures was developed. In this protocol, DNA extraction was omitted by using the Thermo Scientific Phire direct PCR master mix kit for template preparation and PCR. Two primer pairs, ITS5/ITS2 for DNA template quality control and Fg16F/Fg16R for F. graminearum identification, were used in a duplex PCR. Each 20-µL PCR contained 10 µL 2× Phire Direct PCR master mix, 2 µL template and 0.25 µM each of the four primers. The PCR program consisted of an initial denaturation at 98°C for 5 min, followed by 40 cycles of denaturation at 98°C for 5 s, annealing at 62°C for 5 s and extension at 72°C for 20 s, and a final extension at 72°C for 1 min. This protocol was used to test 196 fungal cultures isolated from 75 wheat samples. Fourteen cultures were identified as F. graminearum. This protocol was demonstrated to be simpler and more accurate than other PCR protocols for F. graminearum identification.

Résumé

Un protocole de PCR simple et précis a été développé pour identifier Fusarium graminearum à partir de cultures fongiques. Dans ce protocole, on faisait abstraction de l’extraction de l’ADN en utilisant la trousse de mélange maître de PCR directe à partir de tissu Phire, de Thermo Scientific, pour la préparation de matrices et la PCR. Deux paires d’amorces, ITS5/ITS2 pour le contrôle de la qualité des matrices d’ADN et Fg16F/Fg16R pour l’identification de F. graminearum, ont été utilisées dans le cadre d’une réaction double en chaîne de la polymérase. Chaque 20 µL PCR contenait 10 µL 2 × mélange maître de PCR directe à partir de tissu Phire, 2 µL de matrice et 0.25 µM de chaque amorce. Le programme de PCR consistait en une dénaturation initiale à 98°C pendant 5 minutes, suivie de 40 cycles de dénaturation à 98°C pendant 5 secondes, d’un recuit à 62°C pendant 5 secondes et d’une extension à 72°C pendant 20 secondes, puis d’une étape d’extension finale à 72°C pendant 1 minute. Ce protocole a été utilisé pour analyser 196 cultures isolées à partir de 75 échantillons de blé. Quatorze cultures ont été identifiées en tant que F. graminearum. Ce protocole s’est avéré plus simple et plus précis que d’autres protocoles de PCR utilisés pour identifier F. graminearum.

Keywords:

• diagnosis
• direct PCR
• DNA extraction
• Fusarium head blight
• primer

Mots clés:

• amorce
• brûlure de l’épi causée par le fusarium
• diagnostic
• extraction de l’ADN
• PCR directe

Additional information

Funding

This work was supported by the Alberta Crop Industry Development Fund [grant number 2012C015D] and Western Grains Research Foundation [grant number 2018F092R].