Pathovar specific molecular detection of Xanthomonas campestris pv. campestris, the causal agent of black rot disease in cabbage

Abstract

Various pathovars (pv.) of Xanthomonas campestris (Xc) are prevalent in South Korea, of which pv. campestris causing black rot threatens the production of cabbage in this major cabbage producing country of the world. Rapid and sensitive detection of the pathovar is an essential prerequisite for any plant protection programme. This study took an approach of re-aligning the whole genome sequences (upon availability) of representative strains of the bacteria and identified pathovar-specific genomic regions that are absent in other pathovars and other bacterial strains. Herein, eight Sequence Characterized Amplified Regions (SCAR) primer sets were designed, of which three sets, namely Xcc_48F/R, Xcc_53F/R and Xcc_79F/R, specifically amplified all Xcc strains and did not amplify other pathovars and bacterial strains. These primers also detected the Xcc strains collected from black rot infected field samples in South Korea. After optimizing the PCR conditions, one of the primers, Xcc_48F/R, was able to amplify as low as 6 × 10⁻³ ng μL⁻¹ bacterial DNA. This unique method of marker development thus yielded sensitive, specific and reliable markers that can be used for efficient and inexpensive detection of Xcc for purposes including quarantine and disease forecasting by early detection from asymptomatic field samples. Additionally, the method can be replicated in developing markers from other phyto-pathogenic agents for which the variable genomic regions are not known.

Résumé

Différents pathovars (pv.) de Xanthomonas campestris (Xc) sévissent en Corée du Sud, dont pv. Campestris, causant la pourriture noire, menace la production de chou dans ce pays qui en est un des principaux producteurs dans le monde. Une détection rapide et sensible du pathovar est un préalable essentiel à tout programme de protection des végétaux. L’approche de cette étude est basée sur l’alignement des séquences du génome entier (en fonction de leur disponibilité) des souches représentatives des bactéries et des régions génomiques spécifiques des pathovars identifiées qui sont absentes chez les autres souches de pathovars et de bactéries. En cela, huit jeux d’amorces de régions amplifiées de séquences caractérisées ont été conçus, parmi lesquels les trois suivants, Xcc_48F/R, Xcc_53F/R et Xcc_79F/R, qui ont amplifié en particulier toutes les souches de Xcc et pas celles des autres pathovars ni des autres bactéries. Ces amorces ont également permis de détecter les souches de Xcc prélevées sur des échantillons collectés dans des champs infectés par la pourriture noire en Corée du Sud. Après avoir optimisé les conditions de la PCR, une des amorces, Xcc_48F/R, a pu amplifier aussi peu que 6 × 10⁻³ ng/μL d’ADN bactérien. Cette méthode unique a donc permis de concevoir des marqueurs sensibles, spécifiques et fiables qui peuvent être utilisés pour détecter, efficacement et économiquement, des souches de Xcc aux fins de quarantaine et de prévision de la maladie par un diagnostic précoce à partir d’échantillons asymptomatiques prélevés sur le terrain. De plus, la méthode peut être reproduite pour concevoir des marqueurs pour d’autres agents phytopathogènes pour lesquels les régions variables du génome sont inconnues.

Keywords:

• black rot
• Brassica
• genome
• marker
• pathovars
• PCR
• re-alignment
• Xanthomonas campestris pv. campestris

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Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Joana G. Vicente, University of Warwick, UK for providing known races of Xcc, Xci and Xcr and the Korean Agriculture Culture Collection (KACC), Korea and the International Collection of Microorganisms from Plants (ICMP), New Zealand for providing respective bacterial strains.

Author Contributions

I-SN, J-IP and H-TK conceived and designed the study. SN conducted the in silico analysis. MHR prepared and cultured the samples, isolated DNA and performed wet lab validation. MHR and MRH wrote the manuscript and prepared the tables and figures. UKN extensively revised the manuscript and edited it. KSA cultured the field infected samples and helped in PCR validation. JHL & HJJ prepared the bacterial inocula and managed the field infected samples. All authors read and approved the final draft of the manuscript.

Supplemental material

Supplemental data for this article can be accessed here.

Additional information

Funding

This work was supported by the Center for Horticultural Seed Development (Golden Seed Project, Grant No. 213007-05-3-SB510), Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA), Republic of Korea.