Frequency and genetic variability of the avirulence gene AvrLm4-7 among Leptosphaeria maculans isolates collected in Oklahoma, USA

Abstract

Blackleg, caused by Leptosphaeria maculans, is an important disease of canola, managed primarily through host--plant resistance. Fungal avirulence (AvrLm) genes code for effectors recognized by major host--plant resistance (Rlm) genes. AvrLm4-7 is predominant in the pathogen population in Oklahoma and Kansas, USA, and interacts with the Rlm4 and Rlm7 resistance genes. High-resolution melting analysis and sequencing were used to evaluate the genetic variability of AvrLm4-7 in avirulent (A) and virulent (a) reference isolates, and in isolates (n = 67) collected in Oklahoma from 2014 to 2017. Melting analysis of PCR products from the central primers (493 bp) and from new upstream external primers (105 bp) produced melting profiles that differed among avirulent (AvrLm4-AvrLm7 (A4A7)) and virulent (avrLm4-AvrLm7 (a4A7) and (avrLm4-avrLm7 (a4a7)) pathogen genotypes. Genotypic classification by melting analysis was supported by pathogenicity scores on seedling cotyledons of susceptible, Rlm4, and Rlm7 differentials. All of the local isolates were a4A7 genotypes. In the sequences of a4A7 reference isolates, all showed the expected mutation at bp 358 of C to G resulting in virulence on Rlm4, and silent mutations of either C to T at bp 256 or A to G at bp 134. These two haplotypes displayed unique melting profiles from the central primers in 64% and 36% of local isolates, respectively. Only the central primers produced pathotype-specific melting curves. Sustainable deployment of Rlm7 canola is needed for effective management of blackleg in the region. High-resolution melting will be useful to monitor allelic variability in AvrLm4-7 and for rapid detection of a4a7 strains.

Résumé

La nécrose du collet, causée par Leptosphaeria maculans, est une importante maladie du canola qui se gère principalement grâce à la résistance de la plante hôte. Les gènes d’avirulence fongiques (AvrLm) codent pour les effecteurs reconnus par les principaux gènes de résistance des plantes hôtes (Rlm). AvrLm4-7 prédomine dans les populations d’agents pathogènes de l’Oklahoma et du Kansas, aux États-Unis, et interagit avec les gènes de résistance Rlm4 et Rlm7. La fusion à haute résolution et le séquençage ont été utilisés pour évaluer la variabilité génétique d’AvrLm4-7 chez les isolats de référence avirulents (A) et virulents (a) ainsi que chez les isolats (n = 67) collectés en Oklahoma de 2014 à 2017. L’analyse de la fusion des produits de la PCR, situés sur les amorces centrales (493 bp) et sur de nouvelles amorces externes situées en amont (105 bp), a produit des profils de fusion qui ont varié chez les génotypes des agents pathogènes avirulents (AvrLm4-AvrLm7 [A4A7]) et virulents (avrLm4-AvrLm7 [a4A7] et avrLm4-avrLm7 [a4a7]). La classification génotypique par fusion a été appuyée par les scores de pathogénicité obtenus des cotylédons de plantules de différentiels sensibles Rlm4 et Rlm7. Tous les isolats locaux étaient des génotypes d’a4A7. Dans les séquences des isolats de référence d’a4A7, tous ont affiché la mutation attendue à la bp 358 de C à G, provoquant la virulence à l’égard de Rlm4, et des mutations silencieuses de C ou T à la bp 256 ou de A ou G à la bp 134. Ces deux haplotypes ont affiché des profils de fusion uniques issus des amorces centrales chez 64% et 36% des isolats locaux, respectivement. Le déploiement durable du canola porteur du gène Rlm7 est requis pour gérer efficacement la nécrose du collet dans la région. La fusion à haute résolution sera utile pour suivre la variabilité allélique chez AvrLm4-7 et pour détecter rapidement les souches d’a4a7.

Keywords:

• blackleg
• Brassica napus
• canola
• high-resolution melting
• host-plant resistance
• Leptosphaeria maculans
• oilseed rape

Mots clés:

• Brassica napus
• canola
• colza oléagineux
• fusion à haute résolution
• Leptosphaeria maculans
• nécrose du collet
• résistance de la plante hôte

Acknowledgements

Special thanks to Angela Van de Wouw, University of Melbourne, Australia, for providing the reference isolates of Leptosphaeria maculans used in this study; Nick Larkan and Hossein Borhan, Agriculture and Agri-Food Canada, Saskatoon, for characterizing reference isolates from Oklahoma and providing the Topas Rml1 to Rlm4 and Lep1 to Lep3 isoline differentials; Regine Delourme, INRAE, France, for providing the differential cultivar ‘Bristol’, and USDA/GRIN for providing the ‘Westar’, ‘Quinta’, ‘Glacier’, and ‘Jet Neuf’ differential cultivars.

Disclosure statement

No potential conflict of interest was reported by the author(s).

Additional information

Funding

This project was funded by the USDA/NIFA Specialty and Alternative Crops Program [Grant no. 2018-38624-28794] and the Oklahoma Agricultural Experiment Station [Project no. OKL 02932];