Direct real-time PCR detection of Plum pox virus in field surveys in Ontario

Abstract

A new procedure is described for the detection of Plum pox virus (PPV) in samples from large-scale field tests. The new direct real-time polymerase chain reaction (drtPCR) procedure was based on crude supernatants collected from peach (Prunus persica) leaves macerated in a buffer that was specially developed for this purpose and named “direct pathogen extract buffer.” Specific TaqMan primers and probes were designed for PPV detection: two sets specific to PPV D and M strains, respectively, and one for universal detection of PPV strains D, M, C, EA, and W. These primer and probe sets can be used singly or for duplex differentiation of D and M strains. Using Prunus spp. tissue infected with 30 known fruit tree viruses, the universal primer and probe set correctly identified PPV-infected and PPV-free samples, with no nonspecific cross-reactions. Based on endpoint analysis of the drtPCR reaction, a threshold cyle value of 36 was suggested as the maximum threshold to declare a sample positive for PPV. A comparative analysis comparing drtPCR and ELISA using 12 200 field samples revealed that drtPCR was approximately 100- to 1000-fold more sensitive than ELISA and was able to detect PPV at an earlier stage of infection than ELISA. The drtPCR is a valuable tool for PPV diagnosis and may also be applicable to other studies, including pathogen population dynamics and vector transmission efficiency.

Résumé

L'article fait état d'une nouvelle méthode de détection du virus de la Sharka du prunier (PPV) dans des échantillons recueillis au cours d'études sur le terrain à grande échelle. Cette procédure directe par PCR en temps réel (dtrPCR) est basée sur l'analyse de surnageants bruts issus de feuilles de pêchers (Prunus persica) ayant macéré dans une solution tampon spécialement conçue à cette fin et appelée « tampon d'extraction direct de l'agent pathogène ». Des sondes et des amorces TaqMan spécifiques ont été conçues pour détecter le PPV: deux jeux spécifiques des souches D et M du PPV, respectivement, et une universelle, propre à la détection des souches D, M, C, EA et W. Ces jeux de sondes et d'amorces peuvent être utilizées pour la différenciation simplex ou duplex des souches D et M. À partir de tissus de Prunus spp. infectés par 30 virus connus d'arbres fruitiers, la jeu universel de sondes/amorces a correctement identifié les échantillons infectés par le PPV et ceux qui ne l'étaient pas, sans réaction croisée non spécifique. Basée sur la dernière analyse de la réaction dtrPCR, une valeur C_T de 36 a été suggérée comme seuil maximum permettant d'établir qu'un échantillon était infecté par le PPV. Une analyse comparative, comparant les méthodes drtPCR et ELISA et faisant appel à 12 200 échantillons de champ, a démontré que la méthode dtrPCR était approximativement de 100 à 1000 fois plus sensible que l'ELISA et qu'elle permettait également de détecter le PPV à un stade d'infection plus précoce que l'ELISA. La méthode directe par PCR en temps réel est un outil précieux en ce qui a trait au diagnostic du PPV et peut sans doute être appliquée à d'autres études, incluant la dynamique des populations d'agents pathogènes et l'efficacité de la transmission vectorielle.

Key words:

• disease diagnosis
• polymerase chain reaction
• virus detection
• Sharka disease

Mots-clés:

• diagnostic des maladies
• réaction en chaîne de la polymérase
• détection des virus
• Sharka