Abstract
Se compararon los hidrolizados obtenidos de los subproductos del calamar gigante (cabeza, tentáculos, piel y mezcla) aplicando dos procesos, autohidrólisis (55°C, pH 5,0 y proteasas endógenas) y químico-enzimático (45°C, pH 2,5 y pepsina), mediante el análisis de proteína soluble (PS), grado de hidrólisis (GH) por el método de ortoftaldehído y por el coeficiente de degradación de proteína (CDP) obtenido por la integración de la información del análisis de la imagen de los geles de SDS-PAGE. En la mezcla de subproductos se analizó el perfil de aminoácidos e hidrofobicidad (SoANS) del hidrolizado. Los valores más altos de PS, GH y CDP lo presentaron los hidrolizados de la cabeza, en ambos procesos. La piel requirió más tiempo para hidrolizarse. Los hidrolizados por autohidrólisis presentaron mayor contenido de aminoácidos y SoANS. La actividad enzimática endógena en subproductos ofrece una alternativa económica para aprovechar la cabeza, tentáculos y piel del calamar gigante.
Hydrolysates from jumbo squid by-products (head, tentacle, skin, and mixture) by two different processes, auto-hydrolysis (55°C, pH 5.0 and endogenous proteases) and chemical-enzymatic (45°C, pH 2.5 and pepsin), were compared by soluble protein (SP) content, degree of hydrolysis (DH) by the ortophtaldialdehyde method and, the coefficient of protein degradation (CPD) obtained after image analysis of SDS-PAGE gel. Hydrolysates from by-products mixture were determined amino acid profile and hydrophobicity (SoANS). Head hydrolysates showed the highest SP, DH and CPD values. Skin required more time for hydrolysis than head and tentacle when auto-hydrolysis process. Hydolysates by autohydrolysis showed higher amino acid content and SoANS. The endogenous enzyme activity in squid by-products underwent to produce hydrolysates, offering an economical process for jumbo squid head, tentacle and, skin utilization.
Palabras claves:
Introducción
La industria procesadora del calamar se estima que genera entre un 40–60% de materia seca, la cuales rica en tejidos con alto contenido de proteínas, entre otros componentes (Lin, Citation2006). Debido a que estos desechos ocasionan varios problemas, uno de ellos es la contaminación ambiental, ya que difícilmente se cuenta con lugares adecuados de confinamiento para los residuos provenientes de la industria pesquera, resulta de gran interés buscar alternativas para su aprovechamiento.
Los subproductos del calamar como la cabeza, tentáculos, que no se logran comercializar o bien la piel, son una fuente rica de proteínas y de otros compuestos que pueden ser aprovechados desde el punto de vista nutricional (Kristbergsson & Arason, Citation2007). En la composición química de los subproductos de la pesca, destacan las proteínas. Por sus características, no sólo pueden proporcionan un beneficio en la salud del consumidor, sino que tienen la particularidad de generar productos con propiedades biológicas únicas, por lo que este es un tema que ha despertado interés desde hace algunos años. Una de las alternativas propuestas para la utilización de las proteínas presentes en los subproductos pesqueros es mediante la obtención de hidrolizados (Kristinsson, 2008).
Los hidrolizados son definidos como las proteínas que son, ya sea química o enzimáticamente degradadas hasta la obtención de péptidos de diferente tamaño (Vidotti, Macedo-Viegas, & Carneiro, Citation2003). Los hidrolizados tienen la capacidad de formar soluciones de baja viscosidad aunque éstos se encuentren en altas concentraciones, además no imparten sabor, tienen buena solubilidad, adecuadas propiedades de emulsificación y de espumado, es por ello que los hidrolizados proteícos son aprovechadas en diversas industria (Van der Ven, Gruppen, De Bont, & Voragen, 2002). Los hidrolizados proteicos obtenidos de desechos pesqueros se han aplicado como sustituto de leche para alimentar animales jóvenes, en la obtención de salsas fermentadas, en la producción de caldo peptonado (como medio de cultivo), como agentes gelificantes (Kadam & Prabhasankar, Citation2010) y en la acuícultura (Refstie, Olli, & Standal, Citation2004; Lian, Lee, & Bengtson, Citation2008). Sin embargo, el destino final, dependerá de la materia prima y del proceso que se aplique para la obtención de dichos hidrolizados.
Los métodos de hidrólisis proteica más frecuentemente usados son la hidrólisis enzimática, la hidrólisis ácida y una combinación de ambas. Una hidrólisis alcalina no es recomendable porque ocurre la racemización o la destrucción de ciertos aminoácidos a pH elevados (Neklyudov, Ivankin, & Berdutina, Citation2000). El método ácido tiene la desventaja de que el triptófano se destruye totalmente, mientras que la serina y la treonina se destruyen en un 5–10%; y la asparagina y la glutamina se hidrolizan a sus ácidos correspondientes (Walker & Sweeney, Citation2002). Por el contrario, la hidrólisis enzimática se lleva a cabo en condiciones más suaves de pH y temperatura que reducen la formación de compuestos indeseables (Vioque, Clemente, Pedroche, Yust, & Millan, Citation2001). Son varias las enzimas utilizadas para la obtención de hidrolizados, dentro de las cuales están las proteasas digestivas y las microbianas, incluyendo alcalasa, tripsina, pepsina, quimotripsina, pancreatina, pepsina, termolisina, entre otras (Korhonen & Pihlanto, Citation2006). Aunque este último proceso ofrece un mayor control, a su vez implican mayores gastos o producción de residuos, por lo que una alternativa es mediante el aprovechamiento de la actividad de las enzimas propias del organismo, la autohidrólisis.
Los subproductos de la pesca presentan una alta actividad enzimática, específicamente de proteasas (Leblanc & Gill, Citation1982; Rodger, Weddle, Carig, & Hastings, Citation1984; Sugiyama, Kousu, Hanabe, & Okuda, Citation1989), la cual, bajo condiciones controladas, puede ser aprovechada para la obtención de hidrolizados. El proceso de autohidrólisis ha sido aplicado con éxito para la obtención de hidrolizados a partir de subproductos del calamar Loligo paelei (Lian, Lee, & Park, Citation2005). Del manto de calamar gigante han obtenido hidrolizados usando enzimas comerciales (De la Fuente-Betancourt, García-Carreño, Navarrete del Toro, Córdovoa-Murueta, & Lugo-Sánchez, 2008).
En cuanto a los hidrolizados a partir de los subproductos de calamar gigante, éstos se han centrado principalmente en la piel y usando enzimas comerciales (Mendis, Rajapakse, Byun, & Kim, Citation2005; Giménez, Aleman, Montero, & Gómez-Guillen, Citation2009), por lo que los objetivos centrales en este trabajo son:(1) obtener hidrolizados proteícos de la cabeza, los tentáculos y la piel de calamar gigante aplicando dos sistemas de hidrólisis, uno químico-enzimático y el de autohidrólisis, (2) compararlas características químicas en términos de grado de hidrólisis y perfil electroforético, presentadas por los hidrolizados obtenidos de cada región anatómica, de la mezcla de las tres regiones y según el sistema de hidrólisis aplicado y (3) establecer la composición química, el perfil de aminoácidos y la hidrofobicidad superficial (SoANS) de los peptidos obtenidos a partir de la mezcla de los subproductos. Este trabajo proporciona información de interés para la producción de hidrolizados a partir de los subproductos de calamar gigante mediante la obtención de hidrolizados por un sistema de autohidrólisis, con un potencial uso en la preparación de alimentos para camaronicultura.
Tabla 1. Grado de hidrólisis (GH), concentración de proteína soluble y coeficiente de degradación de proteína (CDP) de los subproductos del calamar gigante obtenidos por autohidrólisis y por el proceso químico-enzimático.
Degree of hydrolysis, soluble protein content, and coefficient of protein degradation (CDP) of jumbo squid by-products obtained by auto-hydrolysis and chemical-enzymatic process.
Tabla 2. Pesos moleculares (kDa) de las principales proteínas visualizadas in SDS-PAGE para cada uno de los subproductos del calamar gigante obtenidos por autohidrólisis y por el proceso químico-enzimático.
Molecular weights (kDa) of the major protein fractions visualized in SDS-PAGE for each jumbo squid by-products, hydrolyzed obtained by auto-hydrolysis and chemical-enzymatic process.
Tabla 3. Composición química de los hidrolizados de subproductos de calamar gigante obtenidos por autohidrólisis y por el proceso químico-enzimático.
Chemical composition of jumbo squid by-products obtained by auto hydrolysis and chemical-enyzmatic process.
Tabla 4. Perfil de aminoácidos de los hidrolizado proteícos de los subproductos de calamar gigante obtenidos por autohidrólisis y por el proceso químico-enzimático.
Amino acid profile of jumbo squid by-products obtained by auto hydrolysis and chemical-enzymatic process.
Figura 1. Cambio del pH durante la producción de los hidrolizados de los subproductos de calamar gigante por autohidrólisis (A) y por el proceso químico-enzimático (B).
pH change during hydrolysis production from jumbo squid by-products by autohydrolysis (A) and chemical-enzymatic process (B).
Figura 2. Evolución del grado de hidrólisis (GH) de los subproductos de calamar gigante obtenidos por autohidrólisis (A) y por el proceso químico-enzimático (B).
Evolution of degree of hydrolysis (GH) in jumbo squid by-products obtained by autohydrolisis (A) and chemical-enzymatic process (B).
Figura 3. Evolución de la proteólisis de los subproductos de calamar gigante obtenido por autohidrólisis. (A) cabeza; (B) tentáculos; (C) piel. El patrón de hidrólisis por SDS-PAGE se obtuvo a diferentes tiempos de muestreo y el cambio de la densidad óptica (megapíxeles/cm2) se estableció de las principales fracciones hidrolizadas durante el proceso aplicado. Los números en las curvas indican los pesos moleculares (kDa) de las principales proteínas estudiadas. La letra M indica los marcadores de peso molecular utilizados: fosforilasa b (92 kDa), albúmina de suero bovino (67 kDa), ovoalbúmina (43 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), SBTI (20,1 kDa) y β-lactoalbúmina (14,4 kDa).
Evolution of proteolysis in jumbo squid by-products obtained by autohydrolisis process. (A) head; (B) tentacle; (C) skin. SDS-PAGE hydrolysis patterns obtained at different sampling times and changes in optical density (megapixels/cm2) of main protein fractions through enzymatic hydrolysis. Numbers of the curves show the molecular weight (kDa) of the main proteins studied. M is molecular weight marker: phosphorylase b (92 kDa), bovine serum albumin (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), SBTI (20.1 kDa) and β-lactalbumin (14.4 kDa).
Figura 4. Evolución de la proteólisis de los subproductos de calamar gigante obtenido por proceso químico-enzimático. (A) cabeza; (B) tentáculos; (C) piel. El patrón de hidrólisis por SDS-PAGE se obtuvo a diferentes tiempos de muestreo y el cambio de la densidad óptica (megapíxeles/cm2) se estableció de las principales fracciones hidrolizadas durante el proceso aplicado. Los números en las curvas indican los pesos moleculares (kDa) de las principales proteínas estudiadas. La letra M indica los marcadores de peso molecular utilizados: fosforilasa b (92 kDa), albúmina de suero bovino (67 kDa), ovoalbúmina (43 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), SBTI (20,1 kDa) y β-lactoalbúmina (14,4 kDa).
Evolution of proteolysis in jumbo squid by-products obtained by chemical-enzymatic process. (A) head; (B) tentacle; (C) skin. SDS-PAGE hydrolysis patterns obtained at different sampling times and changes in optical density (megapixels/cm2) of main protein fractions through enzymatic hydrolysis. Numbers of the curves show the molecular weight (kDa) of the main proteins studied. M is molecular weight marker: phosphorylase b (92 kDa), bovine serum albumin (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), SBTI (20.1 kDa) and β-lactalbumin (14.4 kDa).
Figura 5. Evolución de la proteólisis de la mezcla de subproductos de calamar gigante. (A) Autohidrólisis y (B) Proceso químico-enzimático. El patrón de hidrólisis por SDS-PAGE se obtuvo a diferentes tiempos de muestreo y el cambio de la densidad óptica (megapíxeles/cm2) se estableció de las principales fracciones hidrolizadas durante el proceso aplicado. Los números en las curvas indican los pesos moleculares (kDa) de las principales proteínas estudiadas. La letra M indica los marcadores de peso molecular utilizados: fosforilasa b (92 kDa), albúmina de suero bovino (67 kDa), ovoalbúmina (43 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), SBTI (20,1 kDa) y β-lactoalbúmina (14,4 kDa).
Evolution of proteolysis in jumbo squid by-products mixture. (A) Autohydrolysis and (B) Chemical-enymzatic process. SDS-PAGE hydrolysis patterns obtained at different sampling times and changes in optical density (megapixels/cm2) of main protein fractions through enzymatic hydrolysis. Numbers of the curves show the molecular weight (kDa) of the main proteins studied. M is molecular weight marker: phosphorylase b (92 kDa), bovine serum albumin (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), SBTI (20.1 kDa) and β-lactalbumin (14.4 kDa).
Figura 6. Intensidad de la fluorescencia de los hidrolizados de la mezcla de subproductos de calamar gigante obtenidos por autohidrólisis (-▪-) y por el proceso químico-enzimático (-•-)
Flourescence intensity of jumbo squid by-products mixture obtained by autohydrolysis (-▪-) and by chemical-enzymatic process (-•-).
Materiales Y Métodos
Materia prima
Se partió de la cabeza, tentáculo y piel de 7 especímenes adultos de calamar gigante (Dosidicus gigas) capturados en Puerto Libertad, Sonora durante la temporada de primavera-verano del 2011. Los organismos tenían una longitud de 55–65 cm y un peso de 5,5–6,5 kg. La cabeza, tentáculo y piel se separaron en lotes de 100 g y fueron almacenados a −80°C para su posterior uso.
Obtención de los Hidrolizados
Proceso de autohidrólisis. La actividad enzimática endógena en el musculo de calamar se puede llevar a cabo en amplios rangos de pH, lo cual indica la presencia de proteasas ácidas y alcalinas. Se ha establecido que el pH y la temperatura óptima para la actividad proteolítica en desechos de calamar es de 5,0 y 55°C respectivamente (Lian et al., Citation2005). Para la preparación de los hidrolizados 100 g de cada región anatómica (cabeza, tentáculo y piel) y de la mezcla de dichas regiones, fueron cortadas en tiras delgadas y posteriormente picadas en una picadora de carne (Torrey, modelo 12C, Guadalajara, Jal, México) a altas velocidades por 2 min a temperatura ambiente. Las muestras picadas fueron colocadas en vasos de vidrio de 1000 mL, se mezclaron con agua en una relación 1:5 (p/v), manteniendo el pH a 5,0. Los vasos conteniendo las muestras homogenizadas fueron colocados en un baño de agitación recíproca de 14,5 L (Thermo Scientific, modelo 2870, Marietta, OH, USA) a 55°C. La caída de pH fue un indicador de que se estaba llevando la hidrólisis, observándose que este bajó de 5,0 a 4,1, manteniéndose constante a los 120 min de iniciado el proceso. Por lo que bajo las condiciones seguidas en este trabajo, para el proceso de autohidrólisis se estableció en 120 min.
Proceso de hidrólisis químico-enzimático. Para este proceso, se siguió la metodología descrita por Lin (Citation2006) con ligeras modificaciones. Cada una de las regiones anatómicas y la mezcla fueron primeramente molidas, tal como se describió en el proceso de autohidrólisis. Se pesaron 100 g de las muestras picadas las cuáles fueron colocadas en vasos de precipitado de 1000 mL y se homogenizaron por 2 min con 500 mL de fosfato 50 mM (pH 7,5) a temperatura ambiente. Esta solución amortiguadora favorece la disolución de la muestra. Posteriormente se ajustó el pH a 2,5 con HCl 3 M, pH óptimo para la pepsina. Los vasos conteniendo las muestras homogenizadas fueron colocados en un baño de agitación a 45°C. Una vez que las muestras alcanzaron los 45°C se adicionaron 5 mL de la enzima pepsina (8 mg/mL) (Faga Lab, Mocorito, Sin, México). La pepsina fue preparada justo antes de su uso, manteniendo una relación [E]/[S] 1:12 (esta relación se estableció de los análisis de actividad realizados en la enzima adquirida). El tiempo de hidrólisis para este proceso, también se estableció en función de la subida del pH, observándose que hubo un incremento de pH de 2,5 a 2,9 en 20 min. Por lo que el tiempo en el proceso químico-enzimático bajo estas condiciones se estableció en 20 min.
Monitoreo de la hidrólisis. El grado de hidrólisis de las muestras se monitoreo de la siguiente manera. Para el procesos de autohidrólisis se tomaron muestras a los 30, 60, 90 y 120 min, se colocaron a una temperatura de 100°C por 10 min, con el fin de detener la reacción, posteriormente se centrifugó a 6000 × g por 60 min. Se recuperó el sobrenadante, del cual se tomaron muestras y se llevaron a cabo los análisis del grado de hidrólisis y concentración de proteína soluble, que se describen más adelante. En el proceso químico-enzimático se procedió de manera similar, pero lo muestreos se realizaron a los 0, 10 y 20 min.
Secado de los hidrolizados. El objetivo de esta fase del proceso es concentrar los hidrolizados y facilitar su manejo durante la elaboración de los alimentos. Los hidrolizados fueron secados aplicando el proceso de liofilización (LabConco Freeze Dryer 3, Kansas, MO, USA). El proceso de secado tomó 3 días, la temperatura del sistema se mantuvo a −50° C y la presión fue de 10 mBar.
Evaluaciones Analíticas
Concentración de proteína. La concentración de proteína de los hidrolizados se evaluó por el método de Bradford (Citation1976) utilizando albumina de suero bovino (1 mg/mL) como estándar midiendo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm.
Grado de hidrólisis. Para esta determinación se utilizó el método del ortoftaldehído (OPA) descrito por Nielsen, Petersen, and Dambmann (Citation2001). Este método se basa en la reacción entre los grupos amino y el OPA en presencia de un grupo tiol, formando un compuesto colorido detectable a los 340 nm. (Church, Swaisgood, Porter, & Catignani, Citation1983; Nielsen et al., Citation2001). Todos los reactivos utilizados se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). El estándar de serina se preparó pesando 10 mg de serina en 100 mL de agua deionizada. Para el análisis, se mezclaron 3 mL del reactivo de OPA con 400 µL de la muestra, por 5 s y después de dos min se medía la absorbancia a 340 nm (Varian Cary Conc 50 UV-Visible, Agilent Technologists, Ciudad de México; MEX). Para la obtención del grado de hidrólisis se aplicaron las siguientes ecuaciones:
Determinación de h (Ecuación 1 y Ecuación 2):
Donde
X = µL de muestra
P = porcentaje de proteína en la muestra
0,1 es el volumen de la muestra en un litro
Determinación de grado de hidrólisis (Ecuación 3):
Donde α, β y htot son constantes. En el caso de pescado α, β y htot son 1,00; 0,40 y 8,6 respectivamente (Adler-Nissen, Citation1986).
El grado de hidrólisis se expresó en porcentaje total de hidrólisis de proteínas de pescado. Para cada muestra, se realizaron mediciones por triplicado.
Electroforesis. Los hidrolizados liofilizados, se analizaron por electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) en un sistema MINIPROTEAN III (Bio Rad Laboratorios Chemical, Hercules, CA, USA), usando geles de poliacrilamida al 10%. La concentración de proteína se ajustó 1 mg/mL. Las muestras se trataron de acuerdo a lo descrito por Laemmli (Citation1970). Se tiñeron mediante el reactivo de Commassie. Para determinar los pesos moleculares de las fracciones separadas se incluyó un patrón de marcadores de peso molecular de amplio rango: miosina 200 kDa, β-galactosidasa 116 kDa, fosforilasa β 97 kDa, seroalbumina 66 kDa, ovoalbumina 45 kDa y anhidrasa carbónica 31 kDa.
Los geles fueron analizados utilizando un Analizador de Imágenes Bio Rad GEL DOC XR 170-8170, este se utilizó como una herramienta para obtener resultados cualitativos de los perfiles electroforéticos, el analizador de imágenes proporciona la densidad óptica de las bandas de interés, el software utilizado fue Quantity One Version 4.5.2 1-D Análisis Software BIO RAD (Hercules, CA, USA).
La tasa de hidrólisis se expresó como el Coeficiente de Degradación de Proteína (CDP) (Sáenz de Rodrigáñez, Medina, Moyano, & Alarcón, Citation2011). El CDP se calculó en base al porcentaje de reducción en la densidad óptica de las principales fracciones proteícas identificadas en las muestras antes de la hidrólisis durante el procesos de hidrólisis y la proporción relativas que estas fracciones representan en la concentración total de proteína. La ecuación matemática que se aplicó para el cálculo del CDP se aplicó la ecuación 4:
Donde CPD es el coeficiente de degradación d proteína, i son las fracciones de las principales proteínas identificadas de 1 a n, ODi es la densidad óptica de la fracción proteíca de la banda i, t es el tiempo total de la reacción (Alarcon, Moyano, & Díaz, Citation2001).
Análisis Químico Proximal. Esta determinación se realizó sólo a los hidrolizados liofilizados obtenidos de la mezcla de los subproductos (cabeza, tentáculos y piel). Se estableció el contenido de proteínas, lípidos, cenizas y agua, aplicando la metodología del AOAC (Citation2000).
Análisis de Aminoácidos. El contenido de aminoácidos se determinó siguiendo la metodología de Vázquez-Ortiz, Caire, Higuera-Ciapara, and Hernandez (Citation1995) mediante cromatografía líquida de fase reversa utilizando un sistema HPLC Hewlett-Packard serie 1100 (Waldbronn, Alemania). El método en general consistió en pesar 3 mg de la muestra liofilizada, la cual se colocó en tubos para llevar a cabo la hidrólisis, con HCl 6 N y ácido tioglicólico como antioxidante. A los tubos se les aplicó vacío y se cerraron. Posteriormente, los tubos se calentaron en una placa de calentamiento por 6 h a 150°C. Al término de la hidrólisis se dejaron enfriar y se evaporó el reactivo en un rotavapor Buchi (Buchi, Flawil, Suiza), obteniéndose un concentrado, el cual se resuspendió en 2 mL de buffer de citrato de sodio 0,2 N pH 2,2 y se almacenó en viales a temperatura ambiente hasta su inyección en el cromatógrafo. El área producida por la fluorescencia de los aminoácidos se registró e integró por el programa Chem Station (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA). Los aminoácidos se identificaron y cuantificaron de acuerdo al tiempo de retención y aéreas comparadas con un estándar externo de aminoácidos.
Hidrofobicidad de Superficie (SoANS). Esta última determinación se llevó a cabo solo en los hidrolizados liofilizados obtenidos de la mezcla de los subproductos. Los valores de hidrofobicidad superficial (So) de cada muestra fueron determinados por medio de la sonda fluorescente ANS (ácido 8-anilino 1 naftalen-sulfónico) de acuerdo al método de Hayakawa and Nakai (Citation1985). La hidrofobicidad superficial se determinó como la pendiente inicial de la curva de intensidad de fluorescencia relativa porcentual versus la concentración de proteína según Kato and Nakai (Citation1980).
Análisis Estadísticos
El diseño que se aplicó fue un factorial de dos factores, el factor uno fueron los sistemas de hidrólisis evaluados (autohidrólisis y químico-enzimático) y el dos, la región anatómica (cabeza, aleta, piel y mezcla). Las variables respuesta fueron el grado de hidrólisis y la concentración de proteína. El porcentaje del grado de hidrólisis los hidrolizados obtenidos fuerón normalizados mediante la transformación del arco seno de su raíz cuadrada (Sokal & Rohlf, Citation1981). Para el perfil electroforético se aplicó un análisis descriptivo.
Para el análisis de los datos se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Los datos fueron expresados como el promedio con el error estándar. La prueba de rangos múltiples de Tukey fue utilizada para comparar las diferencias en las medias. El paquete estadístico utilizado fue el JMP 5,0,1.
Resultados Y Discusión
Obtención de los Hidrolizados de Cada Región Anatómica
Los hidrolizados de los subproductos de la pesca (cabeza, tentáculos y piel) del calamar gigante fueron preparados mediante la aplicación de un proceso químico-enzimático y el denominado autohidrólisis (aprovechando las enzimas presentes en el mismo tejido). Con ambos sistemas se logró hidrolizar al tejido (). Se puedo apreciar que con los dos procesos, independiente de la región anatómica evaluadase produjo una variación del pH (), la cual sucede por la generación de iones H+ durante la hidrólisis de las proteínas (Adler-Nissen, Citation1986). La caída del pH durante el proceso de autohidrólsis se podría relacionar con una protonación parcial de los grupos y la subida de pH observada en el proceso químico-enzimático se podría atribuir a la disociación parcial de los grupos carboxilo presentes en las proteínas (Adler-Nissen, Citation1986). La hidrólisis de la proteína se confirma con el estudio electroforético que se presenta a continuación.
Cuando se aplicó el proceso de autohidrólisis se observó que hasta los 60 min de iniciado el proceso la piel comenzó a hidrolizarse, mientras que trabajar con tentáculo y cabeza, esta hidrólisis se detectó desde los 30 min (Figura 2). Estas diferencias se atribuyen al tipo de proteínas que mayoritariamente se encuentran en las regiones evaluadas, mientras que tanto en el tentáculo y como en la cabeza hay una mayor cantidad de proteínas miofibrilares así como de enzimas, la piel se encuentra compuesta principalmente por proteínas estromales (Sikorski & Borderias, Citation1994). Tanto las proteínas miofibrilares como las estromales puden se removidas con la aplicación de sistemas ácidos. Por lo que cuando se usó el método químico-enzimático, no se detectaron diferencias en los tiempos de hidrólisis, pero si en cuanto al grado de hidrolisis. El tiempo establecido para este proceso fue de 20 min. Este menor tiempo requerido para hidrolizar las proteínas sugiere que al trabajar bajo condiciones ácidas se pudo haber provocado el rompimiento de enlaces peptídicos fuertes como los de glicina, alanina y prolina (Neklyudov et al., Citation2000). Siendo estos aminoácidos los que le confieren las propiedades de estabilidad al colágeno, proteína mayoritaria en el tejido estromal (Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, & Darnell, Citation2000).
Concentración de Proteína Soluble. Como ya se mencionó, para obtener los hidrolizados se evaluaron dos procesos y tres regiones anatómicas. En la (), se muestra el contenido de proteína de cada uno de los hidrolizados obtenidos. Independiente del tratamiento aplicado el mayor contenido de proteína soluble se detectó en los hidrolizados de la cabeza (p < 0,05). Aunque se presentó un mayor valor de proteína soluble obtenido con el tratamiento químico (p < 0,05), estono está indicando una mayor hidrólisis, ya que como se comentará más adelante, dichos valores se obtuvieron al trabajar con el proceso de autohidrólisis. La mayor presencia de proteína soluble se puede atribuir principalmente a la pepsina adicionada en el proceso químico, ya que como es ampliamente conocido, las enzimas son proteínas altamente solubles.
Grado de Hidrólisis (GH). Los resultados obtenidos del GH se muestran en la (), donde se aprecia un mayor GH cuando se utilizó como materia prima a la cabeza (p < 0,05). De las tres regiones anatómicas, en la piel es en la que presentó el menor GH cuando se trabajó con el sistema de autohidrólisis (p < 0,05), mientras que en el tentáculo este GH fue el menor pero al aplicar el químico-enzimático (p < 0,05).
En cuanto al menor valor de GH detectado en la piel mediante el sistema de autohidrolisis se puede atribuir a que las enzimas que actúan sobre la principal proteína presente en este tejido, que es el colágeno, son menos activas a las temperaturas en las cuáles se llevó el proceso. Se ha reportado que la temperatura óptima de acción de la colagenasa presente en el músculo del calamar es de 40°C (Okamoto et al., Citation1993) lo que hace presuponer que a 55°C la enzima fue menos eficiente para hidrolizar al tejido. Mientras que otras proteasas como las catepsinas, también detectadas en el músculo del calamar, su máximo de actividad fue a los 65°C (Ayensa, An, Gómez-Guillen, Montero, & Borderias, Citation1999). Este último grupo de enzimas, en conjunto con otras más se encontrarán mayoritariamente en la cabeza y tentáculos, por ello los valores más altos de GH detectados. Así mismo, el mayor valor de GH detectado en la cabeza se atribuye al hecho de que en esta región se localiza el hepatopáncreas o glándula digestiva del calamar y este órgano es rico en enzimas proteolíticas, las cuáles durante la evisceración del organismo pudieron haber migrado hacía el tejido, favoreciéndose de esta manera la hidrólisis en la cabeza.
Al comparar los resultados obtenido por el sistema de autohidrolisis el GH del musculo de la cabeza es mucho más alto (40%) que del tentáculo (21,6%) el cual es similar al reportado por Lian et al. (Citation2005) utilizando como materia prima desechos de Loligo palei. Mientras que los obtenidos aplicando el método químico, el GH de las tres regiones anatómicas fueron mayores a lo reportado para hidrolizados del músculo de tilapia (Oreochromis niloticus) (7,5%) (Foh, Amadou, Foh, Kamara, & Xia, Citation2010), menores a los obtenidos con Arca subcrenata (20%) (Song, Wei, Zhang, Yang, & Wang, Citation2011) pero similares a los de Loligo palei (12%) (Lian et al., Citation2005).
Finalmente, estos resultados indican por lo tanto que el GH obtenido fue afectado tanto por la proteína utilizada como el proceso utilizado, y que la actividad enzimática endógena del calamar fue suficiente para obtener hidrolizados y que la utilización de pepsina, bajo las condiciones de este estudio, tuvo una contribución importante en la obtención de los hidrolizados pero solo a partir de la piel del calamar. Se sabe que el resultado de la hidrólisis global puede ser diferente en función del tipo de proteasas que actúen sobre un sustrato proteico determinado (Adler-Nissen, Citation1986). La pepsina es una endoproteasa que actúa en el interior de las cadenas polipeptídicas (Whitaker, 1994), mientras que en la autohidrólisis pueden actuar varias proteasas (Stanley & Hultin, Citation1984) con distinta especificidad de corte en las cadenas de proteínas. Así mismo, la hidrólisis proteolítica no se desarrolla en una sola reacción, sino que se trata de un conjunto de reacciones simultáneas de ruptura de enlaces, con distintas grupos químicos cargados en equilibrio, lo que da una gran complejidad a este tipo de procesos; primero se debe formar un complejo enzima-sustrato y después se da la ruptura del enlace peptídico, liberándose el péptido, así que para la hidrólisis de proteína, la unión sustrato-enzima es esencial, pero si los enlaces no están muy accesibles para la enzimas, la hidrólisis será menos eficiente (Vioque et al., Citation2001).
Análisis Electroforético. El patrón electroforético de cada una de las regiones anátomicas y sus hidrolizados obtenidos por el proceso de autohidrólisis y químico-enzimático se muestran en las ( y 4). Después de la separación de las fracciones proteicas con SDS-PAGE se detectaron 11 bandas principales en cabeza y tentáculo, mientras que en la piel se observaron 12 fracciones. Al analizar los pesos moleculares relativos de las fracciones separadas, se detectaron diferencias entre las tres regiones (). Para este estudio las bandas fueron agrupadas en función de su similitud en cuanto a pesos moleculares: 114–200 kDa, 78–95 kDa, 51–68 kDa, 38–44 kDa, 30–35 kDa, 20–28 kDa, y las fracciones que estuvieran debajo de los 19 kDa. Aunque no se realizó un estudio de caracterización de las fracciones proteicas separadas, basándose en lo reportado en la literatura, se presupone que las fracciones entre 114–200 kDa están asociadas a proteínas miofibrilares de alto peso moleculara (miosina y alfa-actina), mientras que la de 95 kDa a paramiosina, 51 kDa a elastina y 44 kDa a actina (Astier, Labre, Roustand, & Benyamin, Citation1991; Papa, Alvarez, Verrez-Bagnis, Fleurence, & Benyamin, Citation1996; Verrez-Bagnis, Noel, Sautereau, & Fleurence, Citation1999; Pornrat, Surmate, Rommanee, Sumolaya, & Kerr, Citation2007). Las bandas ligeras (debajo de 38 kDa) pueden asociarse a la degradación de varias proteínas presentes en los tejidos del calamar.
Después del proceso de hidrólisis se observaron diferencias importantes en los patrones electroforéticos (). La densidad óptica relativa de las fracciones proteicas separadas, antes y después de la hidrólisis, expresada como el porcentaje del total de la densidad óptica del SDS-PAGE de las proteínas separadas () confirman que se llevó a cabo la hidrólisis en las tres regiones anatómicas estudiadas y con ambos procesos aplicados, además corrobora que la mayor hidrólisis se presentó al trabajar con la cabeza del calamar gigante y con el sistema de autohidrólisis. Así mismo, al observar la () se confirma que la proteína presente en la piel tardó más de tiempo para comenzar a hidrolizarse que las otras dos regiones anatómicas.
Al darle seguimiento al proceso de autohidrólisis mediante SDS-PAGE () se apreció en general una tendencia a disminuir la intensidad de las principales fracciones proteícas, sin embargo, tanto en los hidrolizados obtenidos a partir de los tentáculos cómo en la piel, después de un determinado tiempo la densidad óptica de algunas de estas fracciones vuelve a incrementarse ( y ).
Al evaluar el comportamiento de los hidrolizados obtenidos por el sistema químico-enzimático se detectó la mayor diferencia en el patrón electroforético en los primeros 10 min de iniciado el proceso de hidrólisis (). En los hidrolizados obtenidos a partir de la cabeza, después de los 10 min se apreció que la densidad óptica de algunas fracciones vuelve a incrementar ().
El gradiente del gel empleado durante la electroforesis es un elemento que puede ser un inconveniente para poder realizar un seguimiento más preciso de todas las fracciones durante el proceso de hidrólisis (Kevin, Mary, Rottin, & Linhardt, 1987). Se sabe que el uso de geles de poliacrilamida de concentración homogénea durante la electroforesis, cómo el del presente estudio, presenta la limitante de que no resuelve adecuadamente fracciones heterogéneas. Por lo que, el hecho de que algunas fracciones proteicas vuelvan a ser más evidentes se puede atribuir a la condiciones electroforéticas empleadas en el presente trabajo ya que durante la hidrólisis de las proteínas se producen péptidos de diferentes tamaños, incluso con pesos moleculares muy cercanos (Adler-Nissen, Citation1986) induciendo así la producción de una solución proteíca heterogénea.
La combinación del seguimiento del grado de hidrólisis de las proteínas con la técnica de SDS-PAGE, permitió identificar las fracciones presentes en los hidrolizados. Así mismo el análisis de los proteinogramas permitió expresar de manera numérica el porcentaje de reducción en la densidad óptica de cada fracción proteíca después del tiempo de reacción. Se observaron valores muy similares entre los valores de CDP y GH en los hidrolizados obtenidos por autohidrólisis, no así con los que arrojaron con los producidos bajo el proceso químico-enzimático. La tendencia general en el GH por el proceso químico-enzimático es a presentar valores más bajos. El reactivo de OPA puede llegar a reaccionar con algunos aminoácidos presentes en las muestras que se estén analizando y esto contribuir a sub o sobre estimar el GH (Spellman, McEvoy, Cuinn, & FitzGerlad, 2003). En el presente estudio no se realizó el análisis de aminoácidos a las tres regiones anatómicas, solo a la mezcla de las mismas, en dicha mezcla se pudo apreciar que los hidrolizados obtenidos por el proceso químico-enzimático son ricos en taurina, como se muestra a continuación, lo cual pudo contribuir a los menores valores de GH obtenidos. Sin embargo habría que realizar otros análisis para corroborar lo antes mencionado.
Obtención de los Hidrolizados de la Mezcla
Después del proceso de hidrólisis se confirmó que el mayor grado de hidrólisis de la mezcla se obtiene al trabajar con el sistema de autohidrolizado (), similar a lo observado cuando se trabajó con cada región anatómica. Los valores del GH y del CDP se relacionan más con el comportamiento del tentáculos, sin embargo cuando se analizaron las fracciones proteicas separadas por SDS-PAGE () se observó un menor número de fracciones proteícas, además de fracciones con pesos moleculares mayores a los 66 kDa. Este comportamiento se pudiese atribuir a una mayor concentración de tejido conectivo en la mezcla, ya que en la misma se tenían dos regiones que se caracterizan por ser ricas en colágeno, los tentáculos y la piel (Torres-Arreola, Pacheco-Aguilar, Sotelo-Mundo, Rouzaud-Sandez, & Ezquerra-Brauer, Citation2008; Paredi, De Vido de Mattio, & Crupkin, 1998).
Al analizar en detalle el patrón electroferético, se observa que primero se llevó a cabo la hidrólisis de las proteínas miofibrilares con pesos moleculares 65–100 kDa, así como una degradación de proteínas que podrían ser del tejido conectivo, debido a que se apreció la aparición de fracciones de peso molecular mayor a los 150 kDa, en conjunto con un incremento en la región de los 65–100 kDa, además comienza a observarse un incremento en las fracciones con un rango de peso molecular de 35–50 kDa. Esto sugiere que en los primeros 30 min de iniciado el proceso comenzó la hidrólisis de las proteínas miofibrilares y a partir de los 90 min comenzó la de las proteínas del tejido conectivo. Finalmente, se confirma que se llevó a cabo la hidrólisis de la mezcla ya que se apreció un incremento constante en las fracciones de bajo peso molecular (18–30 kDa).
En cuanto al análisis químico proximal de los hidrolizados, el contenido de proteínas, cenizas y humedad, se detectaron diferencias significativas (p < 0,05) al comparar el proceso aplicado (). El mayor contenido de proteico detectado en los hidrolizados obtenidos por el proceso de autohidrólisis puede atribuirse a la mayor generación de péptidos producto de la hidrólisis, los cuales pasaron a la fase acuasoluble y que constituyeron la fracción que se sometió a la liofilización (deshidratación) para obtener el hidrolizado (Hoyle & Merrit, Citation1994). Las variaciones en el contenido total de cenizas se han atribuido a la adición ya sea del álcali o el ácido en el acondicionamiento previo de ajuste de pH para máxima actividad de la enzima con la cual se esté trabajando (Liceaga-Gesualdo & Li-Chan, Citation1999), tal como se aplicó en el proceso químico-enzimático. El mayor contenido de ceniza observado los hidrolizados obtenidos por el proceso químico-enzimático también puede ser debido a la posible presencia en el músculo de minerales hidrosolubles que se mantienen en la fracción soluble (Belén-Camacho, Moreno-Álvarez, García, Medina, & Sidorovas, 2007). Las diferencias en humedad detectadas podrían deberse a variaciones en la eficacia de la liofilización y/o al grado de hidrólisis, ya que se ha reportado que a mayor grado de hidrólisis es mayor el contenido de humedad (Sindayikengera & Xia, Citation2006).
La hidrofobicidad superficial (So) se refiere a cambios de energía libre de la unión de una sonda fluorescente no polar como 1-anilinonaftaleno-8-sulfonato (ANS) sobre la superficie de la proteína. Esta propiedad se ha relacionado con el anclaje de la molécula en las interfaces aire/agua y aceite/agua. La So de los peptidos obtenidos por autohidrólisis (32,9) y por el proceso químico-enzimático (15,4) y la relación lineal entre la concentración de proteína y la intensidad de fluorescenia se muestran en la (Figura 6). Se detectaron diferencias significativas entre los hidrolizados obtenidos por el proceso de autohidrólisis y por el químico-enzimático. En una proteína nativa, los aminoácidos hidrofóbicos se acomodan hacía la parte interna de la proteína. Esta propiedad se pierde cuando se desnaturaliza la proteína o bien se hidroliza en peptidos de bajo peso molecular (Wang, Hettiarachchy, Qui, Burks, & Siebenmorgen, Citation1999). Estos resultados indican que en el caso de los hidrolizados por el proceso químico-enzimático hubo una mayor generación de péptidos hidrofílicos de bajo peso molecular con poca afinidad por el ANS.
Un indicador de la calidad nutrimental de una proteína es su contenido de aminoácidos, estableciéndose para el caso particular de camarón, que dentro de su dieta deben estar presentes al menos 10 aminoácidos, que representan aproximadamente el 50% del total de los aminoácidos presentes en una proteína (). En el presente trabajo se detectó que el contenido de aminoácidos en los hidrolizados producidos a partir de los subproductos del calamar gigante, fue diferente entre ambos procesos aplicados, siendo mayor en los producidos por autohidrólisis (). El mayor contenido de aminoácidos detectectados en los hidrolizados obtenidos por el proceso de autohidrólisis se relaciona a su vez con la mayor concentración de proteína y generación de péptidos producto de la hidrólisis, que cómo ya se mencionó pasaron a la fase acuasoluble que posteriormente se sometió a la liofilización. El mayor contenido de aminoácidos presentes en los hidrolizados producidos por autohidrólisis estaría sugiriendo que estos hidrolizados proporcionarían una mayor proporcionde los aminoácidos esenciales requeridos para la engorda de camarones que aquellos obtenidos por el proceso químico-enzimático. Sugiriendo esto que por la autohidrólisis de los subproductos del calamar se obtendría un producto con una mejor calidad proteíca. Por otro lado, al detectarse también una mayor concentración de aminoácidos hidrofóbicos en los hidrolizados producidos por autohidrólisis, podría llegar a explicar el comportamiento observado en las prueba de SoANS.
Conclusiones
En la cabeza de calamar y aplicando el proceso de autohidrólisis a pH 5,0 se obtienen hidrolizados proteíco con los mayores rendimientos y en menor tiempo. Para una mayor hidrolisis de la piel es más adecuado trabajar con sistemas químicos-enzimáticos. La actividad enzimática endógena del calamar gigante es suficiente para obtener hidrolizados con características adecuadas para ser considerados en la inclusión de una dieta para camarón. El proceso de autohidrólisis en la producción de hidrolizados de los subproductos del calamar puede ser una opción para reducir los costos de obtención del producto y una alternativa de aprovechamiento de los desechos pesqueros generados en los distintos procesamientos del calamar gigante.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo otorgado por CONACYT al proyecto 154046 para el desarrollo de este trabajo, así como por las becas otorgadas a Anabel Sánchez-Sánchez y Joe Luis Arías Moscoso para cursar sus estudios de posgrado.
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