Evaluation of Reverse-Transcription PCR Detection of 16S rRNA and Tuf mRNA for Viable/Dead Discrimination of Beer-Spoilage Lactic Acid Bacteria

Abstract

The aim of this study was to evaluate the feasibility of using 16S rRNA and elongation factor (tuf) mRNA as targets for selective detection of viable beer-spoilage lactic acid bacteria (LAB) by reverse-transcription PCR (RT-PCR). One-step real-time RT-PCR was applied to monitor the target transcripts in Lactobacillus brevis, L. lindneri, and Pediococcus damnosus. Three methods were compared for total RNA extraction. To study the correlation between viability and RNA detection, log-phase cultures were inactivated using brewery disinfectant or heating. RT-PCR, denaturing agarose gel electrophoresis, and cultivation were performed before and at various times after the inactivation treatments. A method combining bead-beating with traditional RNA purification provided good RNA yield from LAB. The 16S rRNA and tuf mRNA targets were detected in inactivated cells by RT-PCR throughout a 21-day storage period. Cultivable cells could not be recovered at any postinactivation time. The 16S rRNA degraded with time, and its degradation appeared to be initially faster after disinfection than after heating. The overall degradation patterns between the strains were similar. Our results indicate that tuf mRNA and 16S rRNA can be stable in LAB cells inactivated under conditions they may encounter during the brewing process. Hence, the RT-PCR analysis of these target transcripts may not be a reliable technique for selective detection of viable LAB in brewery samples.

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue evaluar la viabilidad de la utilización del ARNr 16S y factor de elongación (tuf) ARNm como objetivos para la detección selectiva de bacterias viables de ácido láctico (LAB) dañinas a la cerveza por PCR de la transcriptión inversa (RT-PCR). Un paso en tiempo real RT-PCR se aplicó a supervisar las transcripciones de destino en Lactobacillus brevis, L. lindneri, y Pediococcus damnosus. Tres métodos fueron comparados para extracción del ARN total. Para estudiar la correlatión entre la viabilidad y la detección de ARN, cultivos en fase de inicio de sesión fueron inactivadas con desinfectante o de calefacción. RT-PCR, electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante, y el cultivo se realizaron antes y en varias ocasiones después de los tratamientos de inactivación. Un método de combinación de bolas-golpeando con las tradicionales métodos de purificación del ARN proporciona buenos rendimientos de ARN de LAB. El ARNr 16S y metas tuf ARNm se detectaron en las células inactivadas por RT-PCR a lo largo de un período de almacenamiento de 21 días. Células cultivables no se puede recuperar en cualquier momento después de inactivación. El ARNr 16S degradados con el tiempo, y su degradación que parecía ser inicialmente más rápido después de la desinfección que después del calentamiento. Los patrones de degradación general entre las cepas fueron similares. Nuestros resultados indican que tuf ARNm y ARNr 16S podría ser estable en las células LAB inactivados en las condiciones que se podrían encontrar durante el proceso de elaboración de la cerveza. Por lo tanto, el análisis de RT-PCR de estas transcripciones de destino no puede ser una técnica confiable para la detección selectiva de LAB viables en muestras de fábrica de cerveza.

• Beer
• Lactobacillus
• Pediococcus
• RNA
• RT-PCR
• Viability

Palabras clave:

• ARN
• Cerveza
• Lactobacillus
• Pediococcus
• RT-PCR
• Viabilidad