Modelización de la inactivación termosónica de Staphylococcus aureus, un enfoque multifactorial
Modeling Staphylococcus aureus thermosonic inactivaction, a multi-target approach

Abstract

In recent years different emerging technologies have been evaluated such as ultrasound, which is usually combined with other preservation factors in order to increase microbial inactivation. Staphylococcus aureus inactivation was performed by simultaneous application of heat (40, 50, or 60 °C) and low frequency ultrasound (20 kHz) at selected wave amplitudes (60, 75, or 90 µm) in culture broth (a _w 0.96, and pH 3.5) with different concentrations of vanillin (200, 350, or 500 mg/kg). Death curves were fitted with the Fermi model. A synergic effect was observed when temperature is near to 40 °C at different ultrasonic amplitude waves and vanillin concentrations. Several studied combinations of ultrasound, temperature, and vanillin concentration could be applied in the food industry.

En los últimos años se han evaluado diversas tecnologías emergentes como el ultrasonido, el cual es combinado con otros factores de conservación para aumentar su eficacia para la inactivación microbiana. La inactivación de Staphylococcus aureus, se llevó a cabo aplicando simultáneamente temperatura (40, 50 o 60 °C), ultrasonido de baja frecuencia (20 kHz) con diferentes amplitudes de onda (60, 75 o 90 µm), y diferentes concentraciones de vainillina (200, 350 o 500 mg/kg) como antimicrobiano, en medios de cultivo con a _w 0,96 y pH 3,5. Se modelaron las curvas de muerte con el modelo de Fermi. Se encontró un efecto sinérgico de los factores estudiados, especialmente a temperaturas cercanas a 40 °C con diferentes amplitudes de onda ultrasónicas y concentraciones de vainillina. Los resultados obtenidos demuestran que varias de las combinaciones estudiadas podrían tener aplicación en la industria de alimentos.

Palabras clave:

• termosonicación
• enfoque multifactorial
• métodos combinados
• vainillina
• Staphylococcus aureus

Keywords:

• thermosonication
• multi-target approach
• hurdle technology
• vanillin
• Staphylococcus aureus

Introducción

En los últimos años se han evaluado diferentes tecnologías para la conservación de alimentos denominadas emergentes, entre las que se encuentran las altas presiones, pulsos eléctricos, campos magnéticos, luz ultravioleta y ultrasonido de baja frecuencia, las cuales se están evaluando como alternativa a los tratamientos térmicos (Condón, Raso, & Pagán, 2005), para la inactivación de microorganismos y enzimas reduciendo de forma importante el uso de calor o incluso eliminándolo (Señorans, Ibáñez, & Cifuentes, 2003). El ultrasonido de alta intensidad y baja frecuencia, consiste en ondas sonoras cuyas frecuencias se encuentran por encima del umbral de detección del ser humano (>16 kHz). El daño que genera el ultrasonido en las células microbianas es provocado por un fenómeno conocido como cavitación (Gould, 1988). Éste causa la alteración de la membrana celular mediante la formación de pequeñas burbujas, que al romperse cerca de la célula generan ciclos de compresión/expansión (Raso & Barbosa-Cánovas, 2003). Cuando se utilizan bajas frecuencias y altas intensidades, la onda ultrasónica genera altos gradientes de presión, corte y temperatura, provocando el colapso celular mediante la formación de una gran cantidad de poros en la membrana, causando la fuga del líquido intracelular (Piyasena, Moharelo, & McKellar, 2003). También durante la cavitación se generan altas temperaturas que pueden tener efecto sobre los microorganismos, pero estos cambios de temperatura ocurren momentáneamente y sólo en el líquido que rodea a las células, con el consiguiente daño a un número limitado de éstas (López-Malo, Guerrero, & Alzamora, 1999).

El tratamiento con ultrasonido por sí sólo no es suficientemente eficaz para inactivar a los microorganismos presentes en un alimento, por lo que debe combinarse con otros factores que aumenten de forma considerable su efectividad. Se ha comprobado que cuando el ultrasonido se combina con niveles moderados de otros factores como presión (manosonicación), temperatura (termosonicación) o ambos (manotermosonicación), hay un incremento notable en el efecto letal sobre los microorganismos, sin que se presenten alteraciones considerables de las características físicas, químicas y/o sensoriales del alimento (Guerrero, López-Malo, & Alzamora, 2001; López-Malo, Palou, Jiménez-Fernández, Alzamora, & Guerrero, 2005; Mañas & Pagán, 2005). Asimismo, el ultrasonido y la adición de antimicrobianos naturales como la vainillina, tienen la capacidad de inactivar el crecimiento microbiano reduciendo la intensidad del tratamiento térmico (López-Malo, Alzamora, & Argaiz, 1995). La vainillina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehido) es uno de los compuestos de aroma y sabor más utilizados en la industria de los alimentos el cual es generalmente reconocido como seguro. La vainillina posee propiedades antimicrobianas en una gran variedad de hongos y levaduras tanto en estudios in vitro como en sistemas alimenticios y diferentes bebidas (Cerruti & Alzamora, 1996; Fitzgerald, Stratford, Gasson, & Narbad, 2005). Debido a su carácter hidrofóbico, la vainillina se une a los lípidos de la membrana celular y mitocondria haciéndolas más permeables, de esta manera se promueve la salida de componentes celulares, metabolitos e iones, además desestabiliza la membrana citoplasmática y perturba sistemas como el transporte activo de electrones o la fuerza motriz de protones (Burt, 2004).

La combinación de los factores antes mencionados junto con otros como la modificación del pH y a _w, así como la adición de compuestos antimicrobianos, genera un ambiente adverso para el desarrollo de microorganismos indeseables, alterando los mecanismos homeostáticos en las células vegetativas y/o esporas microbianas de una forma cooperativa o sinérgica. Si el proceso involucra la interferencia multifactorial, los requerimientos o niveles de los distintos factores de conservación serán teóricamente menores y, por lo tanto, se producirá un menor daño en la calidad del alimento (Gould, 1995; Mañas, Pagán, & Raso, 2000; Alzamora & López-Malo, 2002). Tradicionalmente se conoce a este tipo de combinaciones multifactoriales como métodos combinados o tecnología de barreras. Aunque se han realizado un gran número de estudios relacionados con la tecnología de barreras, no existe todavía un enfoque sistemático de la aplicación de este concepto, limitado actualmente a muchas tecnologías empíricas artesanales y a algunos cuantos desarrollos intencionales de nuevos productos (Alzamora, Cerruti, Guerrero, & López-Malo, 1995; Señorans et al., 2003; Broda, 2007; Kuldiloke, Eshtioghi, Zenker, & Knorr, 2007).

Para comprender mejor y evaluar la acción que los diversos factores de conservación presentes en la tecnología de barreras ejercen sobre la inactivación de microorganismos, es necesario recurrir al uso de modelos matemáticos. Éstos describen y predicen el crecimiento, supervivencia e inactivación microbiana. Para aplicar modelos matemáticos, primero se obtienen datos poblacionales en función del tiempo, de microorganismos que son cultivados en condiciones controladas con diferentes factores de conservación. Una vez obtenidos los resultados del comportamiento microbiano, se realiza una modelización de tipo primario por medio de ajustes con ecuaciones matemáticas específicas, con la finalidad de obtener diferentes parámetros, los cuales describen los cambios de una población con respecto al tiempo y además dan información acerca del comportamiento del microorganismo (por ejemplo la duración de la fase lag). Posteriormente se lleva a cabo la modelización secundaria, en la cual los parámetros obtenidos en el modelado primario son analizados estadísticamente, con la finalidad de observar cambios en los parámetros por efecto de los factores de conservación estudiados. En este punto se determina qué factores son significativos en el desarrollo del microorganismo, así como la posible existencia de interacciones entre dichos factores. Por último, el análisis estadístico genera ecuaciones que se usan para modelar y/o predecir las respuestas del microorganismo bajo nuevas condiciones (o sus combinaciones), permitiendo la interpolación dentro de los intervalos estudiados (Buchanan & Whiting, 1997; Peleg & Cole, 1998; Alzamora, Tapia, & López-Malo, 2000; Betts & Everis, 2005; Lebert & Lebert, 2006).

El propósito del presente trabajo fue modelizar la inactivación termosónica de Staphylococcus aureus, mediante la aplicación simultánea de ultrasonido de baja frecuencia a diferentes amplitudes de onda, alta temperatura, y diferentes concentraciones de vainillina, en un medio de cultivo con a _w y pH controlados.

Materiales y métodos

Staphylococcus aureus

Se utilizó Staphylococcus aureus (ATCC 29213) obtenido en el laboratorio de microbiología de la Universidad de las Américas Puebla, México. El microorganismo se conservó en agar de soya tripticaseina (Merck, México D.F., México). Para la realización de los diferentes experimentos, el microorganismo se hizo crecer a fase exponencial (10⁹ UFC/mL) inoculando una asada del cultivo puro en 10 mL de caldo soya tripticaseina e incubándolo a 35 °C durante 18 h.

Aplicación de tratamientos termosónicos

Los tratamientos termosónicos fueron realizados en un vaso de doble pared estéril (4,5 cm de diámetro interno, 8,5 cm de altura), en el cual circulaba agua con temperatura controlada mediante un baño de recirculación (modelo 1268–24, Cole-Palmer, Chicago, IL, USA), para mantener la temperatura en 40, 50 ó 60 °C. Se aplicó ultrasonido a 20 kHz con una punta de 25,4 mm de diámetro (CPX-400, Cole-Parmer, Chicago, IL, USA), utilizando amplitudes de 60, 75 ó 90 µm. La punta se mantuvo a 4 cm de distancia del fondo del vaso (López-Malo et al., 2005).

Las combinaciones de los diferentes factores (temperatura, amplitud de onda ultrasónica y concentración de vainillina) a estudiar fueron producidas en el programa Design-Expert (versión 6.0.6, Stat Ease Inc., Minneapolis MN, USA) mediante la aplicación del diseño de superficie de respuesta Box Behnken de un solo bloque (Montgomery, 1998), generándose 17 experimentos a tres niveles (Tabla 1). Para cada tratamiento se inoculó 1mL del microorganismo (≈10⁴ UFC/mL) en 50 mL de caldo soya tripticaseina ajustado a a _w 0,96 con sacarosa y pH de 3,5 con ácido clorhídrico 1N (Fisher, México D.F., México) previamente esterilizado por filtración (tamaño de poro de 10 µm). Se agregó vainillina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en solución alcohólica (10 g/L), la cual fue previamente esterilizada por filtración (10 µm) para ajustar los sistemas a 200, 350 ó 500 mg/kg.

Tabla 1. Diseño experimental Box-Behnken y parámetros del modelo de Fermi (a y t _c ).
Table 1. Box-Behnken's experimental design and Fermi model parameters (a and t _c ).

Experimento	Temperatura	Amplitud de onda	Vainillina	a	tc	R^2
	°C	μm	mg/kg	min	min
1	40	60	350	6,96 ± 0,764	19,05 ± 1,032	0,9986
2	40	75	500	6,16 ± 0,531	15,28 ± 0,904	0,9845
3	40	75	200	23,54 ± 0,349	17,32 ± 1,682	0,9902
4	40	90	350	8,29 ± 0,614	12,71 ± 1,178	0,9933
5	50	60	200	1,31 ± 0,032	6,64 ± 0,941	0,9954
6	50	60	500	0,54 ± 0,021	4,23 ± 0,794	0,9899
7	50	75	350	0,44 ± 0,059	3,77 ± 1,382	0,9806
8	50	75	350	0,17 ± 0,025	3,85 ± 0,941	0,9912
9	50	75	350	1,22 ± 0,076	2,21 ± 0,625	0,9957
10	50	75	350	1,19 ± 0,089	2,22 ± 0,426	0,9846
11	50	75	350	1,36 ± 0,048	2,56 ± 0,307	0,9945
12	50	75	500	2,14 ± 0,038	5,30 ± 0,827	0,9975
13	50	90	200	1,34 ± 0,029	3,89 ± 0,729	0,9902
14	60	60	350	0,45 ± 0,047	1,16 ± 0,683	0,9815
15	60	75	200	0,06 ± 0,012	0,90 ± 0,102	0,9876
16	60	75	500	0,15 ± 0.036	0,84 ± 0,167	0,9816
17	60	90	350	0,13 ± 0,026	0,80 ± 0,159	0,9963

Se tomaron muestras de los medios formulados sujetos a los diversos tratamientos termosónicos, a las que se realizaron diluciones seriadas (1 g/L peptona de caseína, Merck, México D.F., México) y se sembraron en cajas de agar soya tripticaseina por medio del sistema de siembra por dilución en espiral (Autoplate 4000, Spiral Biotech, Norwood, MA, USA) y se incubaron a 35 °C durante 24 h para su lectura en el contador automático de colonias (Q-Count, Spiral Biotech, Norwood, MA, USA). Cada análisis se realizó por triplicado.

Modelización matemática

Las curvas de muerte termosónica de Staphylococcus aureus fueron ajustadas mediante regresión no lineal utilizando el modelo de Fermi (Peleg, 1997), de la cual se obtuvieron los parámetros t_c y a (Ecuación 1) utilizando el programa Kaleida Graph (versión 4.0, Synergy Software, Reading PA, USA):

donde x es la fracción de microorganismos supervivientes expresados como (N/N_o); t es el tiempo al cual se tomó la muestra; t_c es el tiempo que se necesita para reducir al 50% la población inicial es decir el punto de inflexión de la curva de muerte (x = 0,5); y a es la pendiente de la curva en t_c e indica el tiempo al cual hay un cambio de velocidad de muerte a partir del punto de inflexión de la curva.

La modelización secundaria se realizó para cada parámetro del modelo de Fermi, a y t_c , analizando los factores de conservación que resultaron significativos (p < 0,05) y eliminando aquellos que no lo fueron (p > 0,05), asimismo para poder evaluar el ajuste al modelo se realizó la prueba de pérdida de ajuste (Draper & Smith, 1981), la cual consiste en que la varianza residual es particionada en una varianza atribuida a la pérdida de ajuste y al error puro de la misma, indicando un ajuste cuando el valor es no significativo (p > 0,05), generando un polinomio asociado al mismo (Ecuación 2) utilizando el programa Design-Expert (versión 6.0.6, Stat Ease Inc., Minneapolis, MN, USA).

donde y es a ó t_c ; A es la temperatura en°C; B es la amplitud de onda ultrasónica en µm; C es la concentración de vainillina en mg/kg, y β _i son los coeficientes generados mediante el análisis de superficie de respuesta.

Resultados y discusión

Modelización primaria

Al aplicar temperaturas de 60 °C se obtuvieron cinéticas de muerte cuasi-lineales (Figura 1) para S. aureus; sin embargo, cuando se utilizaron temperaturas menores a 60 °C las cinéticas de muerte no presentaron dicha tendencia. Esto fue probablemente provocado por la intervención de los otros factores (amplitud de onda ultrasónica y concentración de vainillina), que afectaron la forma de la curva (velocidad de muerte), esto concuerda con lo postulado por Lee, Zhou, Liang, Feng y Martin (2009) quienes afirman que cuando más de un agente letal está involucrado en un proceso de inactivación se observan diferentes curvas de tipo no lineal, siendo indicativo de la existencia de población microbiana con diferente resistencia a los dos agentes letales. El ajuste de las curvas de muerte de S. aureus con el modelo de Fermi, propuesto para ser utilizado en alimentos por Peleg (1997), fue adecuado con un coeficiente de determinación (R²) promedio de 0,97 ± 0,03. Dicho modelo describe curvas de muerte tanto lineales como del tipo sigmoidea. Otra ventaja del modelo de Fermi es que sus parámetros son interpretados fácilmente en función de la forma de las curvas de muerte. Sin embargo, lo que lo hace aún más atractivo es su capacidad de describir decaimientos muy agudos. Al aplicar el modelo de Fermi (Ecuación 1) a los datos experimentales se obtuvieron sus dos parámetros t_c y a (Tabla 1). Cabe mencionar que Peleg (1997) reporta que alrededor del 90% de la muerte microbiana ocurre en el intervalo t_c  ± 3a. En la Tabla 1 se puede ver claramente el efecto multifactorial (temperatura, amplitud de onda ultrasónica y concentración de vainillina) sobre los parámetros del modelo de Fermi.

Figura 1. Curvas de muerte termosónica de Staphylococcus aureus, en un sistema modelo formulado con a _w 0,96 y pH 3,5, ajustadas (líneas) con el modelo de Fermi para distintos tratamientos: (♦) 500 mg/kg de vainillina, 60 °C y 75 µm; (•) 350 mg/kg de vainillina, 50 °C y 75 µm; (▪) 350 mg/kg de vainillina, 40 °C y 90 µm de amplitud de onda ultrasónica.

Figure 1. Staphylococcus aureus thermosonic death curves in a model system formulated with a_w 0.96 and pH 3.5, fitted (lines) with Fermi model for selected treatments: (♦) 500 mg/kg vanillin, 60 °C, and 75 µm; (•) 350 mg/kg vanillin, 50 °C, and 75 µm; (▪) 350 mg/kg vanillin, 40 °C, and 90 µm ultrasound wave amplitude.

Modelización secundaria

Para el parámetro a, el ajuste mediante el análisis tipo superficie de respuesta fue realizado mediante la transformación de su raíz cuadrada. Los valores fueron significativos (p < 0,05) para los factores de conservación temperatura (A), concentración de vainillina (C), temperatura al cuadrado y la interacción entre temperatura y vainillina (Ecuación 3). La prueba de pérdida de ajuste del polinomio generado no fue significativa (p = 0,24).

En la Figura 2 se observa que cuando se utilizan altos valores de temperatura (>55 °C), el valor de a es menor y no se ve afectado por la concentración de vainillina, ya que este parámetro del modelo de Fermi permanece prácticamente constante. La interacción entre ambos factores se puede observar en los niveles de temperatura más bajos (40–45 °C); existe un claro efecto sinérgico de la temperatura con la vainillina (concentraciones de 300 a 400 mg/kg), el cual provoca una disminución de aproximadamente 50% en el parámetro a. El factor de amplitud de onda ultrasónica no tuvo significancia (p > 0,05) para este parámetro. Mourtzinos, Konteles, Kalogeropoulos y Karathanos (2009) reportaron que las bacterias Gram-negativas son más sensibles que las Gram-positivas ante la presencia de vainillina, y que la concentración mínima inhibitoria para S. aureus es de 1200 mg/kg. También se han publicado una gran cantidad de estudios acerca del efecto de la vainillina como sustancia antimicrobiana en diferentes tipos de microorganismos (Cerrutti & Alzamora, 1997; Delaquis, Stanich, & Toivonen, 2005; López-Malo et al., 2005; Rupasinghe, Boulter-Bitzer, Ahn, & Odumeru, 2006; Ngarmsak et al., 2006), en los cuales el factor común es el requerimiento de altas concentraciones de vainillina para inhibir el crecimiento microbiano (entre 1000 y 1500 mg/kg para inhibición in vitro). En nuestro caso, la combinación de temperatura, a _w y pH favorece la utilización de menores concentraciones de vainillina para inactivar a S. aureus. Para que la vainillina tenga un efecto inhibitorio observable, Mourtzinos et al. (2009) consideran como punto crítico el pH, ya que la molécula de vainillina es más activa cuando se encuentra en un estado no disociado; se afirma que a mayor pH, mayor actividad antimicrobiana. En este estudio, a pesar de que el pH es bajo (3,5) y, por tanto, se supone se tiene un alto grado de disociación molecular en la vainillina, tanto la temperatura como la acción de las ondas ultrasónicas, juegan un papel importante incrementando la inactivación de S. aureus, debido probablemente a que provocan un aumento en la energía cinética de las moléculas del antimicrobiano. Fitzgerald et al. (2004) afirman que el mecanismo primario de acción de la vainillina es sobre la membrana celular, ya que causa una disipación de los gradientes iónicos y la inhibición de la respiración celular.

Figura 2. Gráfica de superficie de respuesta para el parámetro a (pendiente de la curva en t_c , tiempo para disminuir el 50% de la población) del modelo de Fermi para las curvas de muerte termosónica de Staphylococcus aureus en un sistema modelo formulado con a _w 0,96 y pH 3,5.

Figure 2. Response surface graph for Fermi model parameter a (slope of the curve at t_c , time to reduce 50% of the population) for Staphylococcus aureus thermosonic death curves in a model system formulated with a _w 0.96 and pH 3.5.

Por lo que respecta al parámetro t_c , como se observa en la Ecuación 4 sólo los factores de temperatura (A), amplitud de onda ultrasónica (B), temperatura al cuadrado e interacción temperatura–amplitud de onda ultrasónica fueron significativos (p < 0,05). La prueba de falta de ajuste del polinomio generado no fue significativa (p = 0,12). Para ambas modelizaciones (a y t_c ) se encontraron valores de significancia estadística, así como su no significancia en la prueba de pérdida de ajuste lo que indica que los dos modelos tienen un buen ajuste. Además, los valores de R² para ambos modelos fueron >0,90.

En la gráfica de la superficie de respuesta (Figura 3) para t_c , se aprecia un comportamiento similar al presentado por el parámetro a; así para altas temperaturas se logra el menor t_c con independencia del valor de la amplitud de onda del ultrasonido. Asimismo, el efecto sinérgico de la amplitud de onda se observa claramente a bajas temperaturas (40–45 °C), causando una disminución importante en el valor de t_c . Piyasena et al. (2003) indicaron que el daño provocado por ultrasonido en diversos microorganismos es debido a la amplitud de las ondas ultrasónicas, concluyendo que dichas ondas no afectan a las paredes celulares, sino que el daño principal se centra en la doble capa lipídica de las membranas celulares. Esto permite comparar con trabajos publicados recientemente, como el de Ugarte-Romero, Feng, Martin, Cadwallader y Robinson (2006) quienes reportan comportamientos similares de inhibición con temperatura de 40 °C y diferentes amplitudes de onda ultrasónica en la inactivación de E. coli en sidra de manzana, y observan el mismo fenómeno que el observado en este trabajo cuando aplican temperaturas cercanas a los 60 °C, a las cuales la amplitud de onda de ultrasonido no tiene un efecto significativo (p > 0,05) en el proceso de inactivación de E. coli. Walkling-Ribeiro et al. (2009) reportaron una inactivación de tipo lineal para S. aureus en jugo de naranja reconstituido, utilizando valores similares (a los de este trabajo) de amplitud de ondas ultrasónicas y temperatura, pero sin la adición de ningún tipo de antimicrobiano, logrando una reducción microbiana del mismo orden, pero con mayores tiempos (30 min) de tratamiento.

Figura 3. Gráfica de superficie de respuesta para el parámetro t_c (tiempo para disminuir el 50% de la población) del modelo de Fermi para las curvas de muerte termosónica de Staphylococcus aureus en un sistema modelo formulado con a _w 0,96 y pH 3,5.

Figure 3. Response surface graph for Fermi model parameter t_c (time to reduce 50% of the population) for Staphylococcus aureus thermosonic death curves in a model system formulated with a _w 0.96 and pH 3.5.

Conclusiones

Las curvas de muerte de S. aureus se ajustaron adecuadamente con el modelo de Fermi. A valores cercanos a 60 °C, la temperatura es el factor dominante en la velocidad de muerte; sin embargo cuando los valores de temperatura son cercanos a 40 °C, existe un efecto sinérgico de los diferentes factores estudiados en la inactivación de S. aureus, utilizándose menores concentraciones de vainillina que las reportadas cuando este antimicrobiano se utiliza sin tratamientos termosónicos. La combinación de factores como a _w, pH, amplitud de onda ultrasónica, temperatura, y antimicrobianos demuestra tener potencial para la industria de alimentos. Sin embargo es necesario realizar más estudios para generar las bases de una pasteurización efectiva utilizando un enfoque multifactorial.

Agradecimientos

Agradecemos al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) de México por el financiamiento de los proyectos 44088 “Enfoque multifactorial en la inocuidad y estabilidad de alimentos vegetales: productos de frutas” y 84859 “Combinación de factores físicos y químicos para la inhibición de microorganismos relacionados con alimentos” de los cuales es parte este trabajo. Los autores Avila-Sosa y Gastélum agradecen al CONACyT y a la Universidad de las Américas Puebla por las becas recibidas para sus estudios doctorales.