Effect of ultrasound treatment on antioxidant activity and structure of β-Lactoglobulin using the Box–Behnken design

Figures & data

Figure 1. HPLC chromatographic of β-Lactoglobulin. (A) β-Lactoglobulin (standard), (B) β-Lactoglobulin (untreated), (C) ultrasound-treated 45°C—20 min—amplitude (AP) 30%, (D) ultrasound-treated 45°C—10 min—AP 20%, (E) ultrasound-treated 45°C—30 min—AP 40%.

Figura 1. Cromatografía HPLC de β-lactoglobulina. (A) β-lactoglobulina (Estándar), (B) β-lactoglobulina (Sin tratamiento), (C) Con tratamiento de ultrasonido 45°C – 20 min – Amplitud (AP) 30%, (D) Con tratamiento de ultrasonido 45°C – 10 min – AP 20%, (E) Con tratamiento de ultrasonido 45°C – 30 min – AP 40%.

Figure 2. Effect of three factors on the DPPH radical scavenging activity of β-Lactoglobulin. The concentration of untreated and ultrasound-treated β-Lactoglobulin was 1% (ω/v). (a) Ultrasound-treated 20 min, AP 30%, varying temperature from 40 to 55°C, (b) ultrasound-treated 45°C, AP 30%, varying time from 10 to 30 min, (c) ultrasound-treated 45°C, 20 min, varying amplitude from 20% to 40%.

Figura 2. Efecto de los tres factores en la actividad de eliminación de radicales de DPPH de la β-lactoglobulina. La concentración de β-lactoglobulina sin tratamiento y con tratamiento de ultrasonido fue 1% (ω/v). (a) Con tratamiento de ultrasonido 20 min, AP 30%, variando la temperatura de 40 a 55°C, (b) Con tratamiento de ultrasonido 45°C, AP 30%, variando la duración de 10 a 30 min, (c) Con tratamiento de ultrasonido 45°C, 20 min, variando la amplitud de 20 a 40%.

Table 1. Box-Behnken design and its responses.

Tabla 1. Diseño Box-Behnken y sus respuestas.

	X1	X2	X3	Response
	Temperature	Time	Amplitude	DPPH radical scavenging activity (%)
Experiments	(°C)	(min)	(%)	Experimental	Predicted
1	+1 (50)	+1 (30)	0 (30)	44.19	44.12
2	+1 (50)	−1 (10)	0 (30)	45.31	45.52
3	+1 (50)	0 (20)	−1 (20)	46.27	46.16
4	+1 (50)	0 (20)	+1 (40)	43.88	43.85
5	−1 (40)	0 (20)	+1 (40)	44.86	44.97
6	−1 (40)	0 (20)	−1 (20)	45.55	45.58
7	−1 (40)	−1 (10)	0 (30)	45.60	45.67
8	−1 (40)	+1 (30)	0 (30)	44.72	44.51
9	0 (45)	+1 (30)	−1 (20)	46.07	46.25
10	0 (45)	+1 (30)	+1 (40)	42.99	43.09
11	0 (45)	−1 (10)	+1 (40)	46.26	46.08
12	0 (45)	−1 (10)	−1 (20)	45.91	45.82
13	0 (45)	0 (20)	0 (30)	57.54	57.48
14	0 (45)	0 (20)	0 (30)	57.32	57.48
15	0 (45)	0 (20)	0 (30)	57.59	57.48

Table 2. Variance analysis of DPPH radical scavenging activity.

Tabla 2. Análisis de varianza de la actividad de eliminación de radicales de DPPH.

Source	Sum of squares	df	Mean square	F-value	P-value Prob>F
Model	377.5608	9	41.9512	839.7237	< 0.0001
X1-Temperature	0.1458	1	0.1458	2.9184	0.1483
X2-Time	3.2640	1	3.2640	65.3347	0.0005
X3-Amplitude	4.2195	1	4.2195	84.4606	0.0003
X1X2	0.0144	1	0.0144	0.2882	0.6144
X1X3	0.7225	1	0.7225	14.4620	0.0126
X2X3	2.9412	1	2.9412	58.8736	0.0006
X1^2	148.7854	1	148.7854	2978.1900	< 0.0001
X2^2	141.0371	1	141.0371	2823.0950	< 0.0001
X3^2	132.7201	1	132.7201	2656.6150	< 0.0001
Residual	0.2498	5	0.0410
Lack of fit	0.2085	3	0.0695	3.3687	0.2373
Pure error	0.0412	2	0.0206
Cor total	377.8106	14

Comment: R² = 0.9993, adjusted R² = 0.9981, predicted R² = 0.9909, adequate precision = 78.8960.

Nota: Comentario: R² = 0.9993, R² ajustado = 0.9981, R² pronosticado = 0.9909, Precisión adecuada = 78.8960.

Figure 3. Response surface plots showing the effect of three factors and their interactions on the DPPH radical scavenging activity of β-Lactoglobulin. (a) Ultrasonic temperature and ultrasonic time, (b) ultrasonic amplitude and ultrasonic time, (c) ultrasonic amplitude and ultrasonic temperature.

Figura 3. Diagramas de superficies de respuesta que constatan los efectos de los tres factores y sus interacciones en la actividad de eliminación de radicales de DPPH de la β-lactoglobulina. (a) Temperatura ultrasónica y tiempo ultrasónico, (b) Amplitud ultrasónica y tiempo ultrasónico, (c) Amplitud ultrasónica y temperatura ultrasónica.

Figure 4. The ABTS radical scavenging activity of ultrasound-treated β-Lactoglobulin.

Figura 4. Actividad de eliminación de radicales ABTS de la β-lactoglobulina con tratamiento de ultrasonido.

Figure 5. The decay curve and oxygen radical absorbance capacity of inhibition on fluorescence by ultrasound-treated β-Lactoglobulin. (a) Decay curve of β-Lactoglobulin, (b) oxygen radical absorbance capacity of β-Lactoglobulin.

Figura 5. Curva de decaimiento y capacidad de absorción de radicales de oxígeno de inhibición en fluorescencia por la β-lactoglobulina con tratamiento de ultrasonido. (a) Curva de decaimiento de la β-lactoglobulina, (b) Capacidad de absorción de radicales de oxígeno (CARO) de la β-lactoglobulina.

Table 3. Enthalpy and transition temperatures of untreated and ultrasound-treated β-Lactoglobulin solution (1%, ω/v).

Tabla 3. Entalpía y temperaturas de transición de una solución (1%, ω/v) de β-lactoglobulina sin tratamiento y con tratamiento de ultrasonido.

	Transition temperatures
Sample	To(°C)	Tp(°C)	Tc(°C)	Enthalpy ∆H(J/g)
β-Lactoglobulin (standard)	71.91 ± 2.14	93.71 ± 4.11	107.24 ± 2.16	0.59 ± 0.04^a
β-Lactoglobulin (untreated)	71.08 ± 2.78	92.56 ± 4.04	109.62 ± 3.23	0.63 ± 0.06^a
Ultrasound-treated 45°C—20 min—AP 30%	64.28 ± 3.02	101.29 ± 3.16	110.17 ± 2.62	0.79 ± 0.13^b
Ultrasound-treated 45°C—10 min—AP 20%	65.09 ± 1.95	95.82 ± 3.26	106.52 ± 2.64	0.68 ± 0.24^a
Ultrasound-treated 45°C—30 min—AP 40%	58.13 ± 2.29	109.55 ± 2.14	112.68 ± 3.09	0.83 ± 0.17^b

Column with different uppercase letter means significant difference at p < 0.05.

Nota: Las columnas con distintas letras en superíndice indican diferencias significativas a nivel de p < 0.05.

Table 4. Secondary structure of β-Lactoglobulin untreated and ultrasound treated (0.05 mg/mL).

Tabla 4. Estructura secundaria de β-lactoglobulina sin tratamiento y con tratamiento de ultrasonido (0.05 mg/mL).

Sample	A	B	C	D	E
α-helix (%)	16.9 ± 0.16^a	21.8 ± 0.44^a	35.8 ± 0.09^b	39.6 ± 0.13^c	29.1 ± 0.20^b
β-sheet (%)	38.0 ± 0.09^a	33.3 ± 0.2^a	39.6 ± 0.34^b	47.2 ± 1.09^c	49 ± 1.17^c
β-turn (%)	17.4 ± 1.10^b	16.7 ± 1.08^b	15.2 ± 1.06^a	10.7 ± 2.04^a	12.6 ± 2.14^a
Random coil (%)	27.7 ± 0.36^c	28.2 ± 0.63^c	9.4 ± 0.34^b	2.5 ± 0.09^a	9.3 ± 0.14^b

Note: A: β-Lactoglobulin (standard); B: β-Lactoglobulin (untreated);

C: Ultrasound-treated 45°C—20 min—amplitude (AP) 30%; D: Ultrasound-treated 45°C—10 min—AP 20%; E: Ultrasound-treated 45°C—30 min—AP 40%.

Column with different uppercase letter means significant difference at p < 0.05.

Nota: A: β-lactoglobulina (Estándar); B: β-lactoglobulina (Sin tratamiento); C: Con tratamiento de ultrasonido 45°C – 20 min – Amplitud (AP) 30%; D: Con tratamiento de ultrasonido 45°C – 10 min – AP 20%; E: Con tratamiento de ultrasonido 45°C – 30 min – AP 40%

Las columnas con distintas letras en superíndice indican diferencias significativas a nivel de p < 0.05.

Figure 6. CD spectroscopy of untreated and ultrasound-treated β-Lactoglobulin. (a) The far UV-CD spectra of untreated and ultrasound-treated β-Lactoglobulin (0.05%, ω/v), (b) the near UV-CD spectra of untreated and ultrasound-treated β-Lactoglobulin (1%, ω/v).

Figura 6. Espectroscopía CD de β-lactoglobulina sin tratamiento y con tratamiento de ultrasonido. (a) Espectro UV-CD lejano de β-lactoglobulina sin tratamiento y con tratamiento de ultrasonido (0.05%, ω/v), (b) Espectro UV-CD cercano de β-lactoglobulina sin tratamiento y con tratamiento de ultrasonido (1%, ω/v).

Figure 7. Microstructure of β-Lactoglobulin untreated and ultrasound treated determined by scanning electron microscopy. (a) β-Lactoglobulin (standard), (b) β-Lactoglobulin (untreated), (c) ultrasound-treated 45°C—20 min—AP 30%, (d) ultrasound-treated 45°C—10 min—AP 20%, (e) ultrasound-treated 45°C—30 min—AP 40%.

Figura 7. Microestructura de la β-lactoglobulina sin tratamiento y con tratamiento de ultrasonido determinada por el microscopio electrónico de barrido. (a) β-lactoglobulina (estándar), (b) β-lactoglobulina (Sin tratamiento), (c) Con tratamiento de ultrasonido 45°C – 20 min – AP 30%, (d) Tratamiento de ultrasonido 45°C – 10 min – AP 20%, (e) Tratamiento de ultrasonido 45°C – 30 min – AP 40%.