Abstract
Response surface methodology (RSM) was employed to evaluate the effect of flow (2, 2.5 and 3 mL/min) and gradient of elution (A: water; B: methanol, step 35–45–55% B, 40–50–60% B and 45–55–65% B) on polyphenols separation from organic-aqueous murta leaves extract by Sephadex LH-20 chromatography. Six fractions were collected from extracts to which response was measured as total polyphenols and antimicrobial activity against Staphylococcus aureus. The models obtained showed that variables are significant for the inhibition activity of fraction 6 against S. aureus (p ≤ 0.05). The best separation condition of this fraction was obtained in the area where the flow is 2.5 mL/min (medium level) and the mobile phase contains a lower methanol percentage. The inhibitory activity of fraction 6 was explained by the flavan-3-ol compounds of lower molecular weight, not present in other fractions.
Mediante metodología de superficie de respuesta se evaluó el efecto de las variables flujo (2, 2,5 y 3 mL/min) y gradiente de elución (A: agua; B: metanol, escalón 35–45–55% B, 40–50–60% B y 45–55–65% B) sobre la separación de polifenoles del extracto orgánico-acuoso de hojas de murta por cromatografía en Sephadex LH-20. Los extractos eluidos fueron colectados en seis fracciones, a las que como respuesta se les midió polifenoles totales y actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus. Los modelos obtenidos demostraron que las variables estudiadas son significativas para la actividad inhibitoria de la fracción 6 sobre S. aureus (p ≤ 0,05). La mejor condición de separación de esta fracción resultó en el área donde el flujo es 2,5 mL/min (nivel central) y la fase móvil contiene un menor porcentaje de metanol. La actividad inhibitoria de la fracción 6 estaría explicada por los compuestos flavan-3-ol de menor peso molecular, no presentes en las fracciones restantes.
Introducción
La murta, Ugni molinae Turcz., es un arbusto nativo del sur de Chile que desde hace algunos años es también cultivado en Nueva Zelanda y Australia. Sus bayas comestibles poseen agradable sabor y aroma y sus hojas y ramas han sido tradicionalmente empleadas en infusiones para tratar enfermedades del tracto urinario, diarreas y disenterías (Montenegro, 2002; Suwalsky, Orellana, Avello, & Villena, Citation2006).
Este arbusto ha sido objeto de estudios recientes respecto de su composición polifenólica y actividad antioxidante (Rubilar et al., Citation2006), propiedades antiinflamatorias (Aguirre et al., Citation2006), analgésicas (Delporte et al., Citation2007), protectoras contra el daño oxidante de eritrocitos humanos (Suwalsky et al., Citation2006) y actividad antimicrobiana (Shene et al., Citation2009). Es así como se ha evidenciado un creciente interés por estudiar sus propiedades y encontrar nuevas aplicaciones a los compuestos polifenólicos presentes en esta matriz vegetal. Entre los distintos usos posibles, su aplicación en alimentos estaría basada en la necesidad de reemplazar aditivos sintéticos, cuya seguridad para la salud del hombre está siendo cuestionada actualmente.
En relación a la actividad antimicrobiana, estudios han mostrado que los extractos crudos de hojas son más efectivos que los de bayas debido al mayor contenido de compuestos polifenólicos. A su vez, estos estudios han mostrado que los extractos de hoja inhiben el crecimiento de organismos patógenos tales como Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 y no muestran actividad frente a bacterias lácticas ni frente a hongos (Shene et al., Citation2009).
Entre los microorganismos patógenos sensibles a los extractos de murta, S. aureus es de importancia en temas alimentarios puesto que esta bacteria puede llegar fácilmente a los alimentos a través de los manipuladores de alimentos, que pueden ser portadores sanos de estos microorganimos que se encuentran en fosas nasales, piel o garganta (Kérouanton et al., Citation2007). S. aureus es la segunda causa de intoxicaciones después de Sallmonella, su presencia en alimentos es un indicador de prácticas sanitarias o de producción defectuosas.
Hasta ahora, en hoja de murta sólo han sido evaluados extractos crudos. Sin embargo, es posible que la actividad de un extracto crudo pueda verse modificada en función de la aplicación de una técnica de separación que permita recuperar distintas fracciones polifenólicas. Existen técnicas de purificación como la cromatografía en gel que ha sido utilizada en la separación de compuestos polifenólicos a partir de distintas matrices vegetales (Kennedy & Taylor, Citation2003; Chakraborty & Mitra, Citation2008; Kato, Tokunaga, & Sakan, Citation2009). Los empaques más frecuentemente utilizados son Sephadex G-25, LH-20 (Sánchez, Sineiro, & Nuñez, Citation2008; Torres & Bobet, Citation2001; Jerez, Touriño, Sineiro, Torres, & Núñez, Citation2007) y Toyopearl TSK HW 40 (Kantz & Singleton, Citation1990; Karonen, Loponen, Ossipov, & Pihlaja, Citation2004). En hoja de murta no hay información científica disponible respecto de la separación de compuestos polifenólicos mediante esta técnica.
Por tanto, el presente trabajo tiene por objetivo determinar el efecto de variables de separación cromatográfica en gel sobre la separación de los componentes fenólicos presentes en extractos de hojas de murta, y evaluar su actividad antimicrobiana frente a S. aureus ATCC 25923. La información respecto de la actividad de las fracciones separadas ayudará a definir sus posibles aplicaciones como antimicrobianos alimentarios.
Materiales y métodos
Extracto crudo
Se trabajó con hojas de murta colectadas durante enero de 2008 en la localidad cordillerana de Villarrica en la región de La Araucanía. El material colectado fue secado a 35°C hasta peso constante. Las hojas de murta fueron trituradas en un molino de café y tamizadas (Tamiz W.S. Tyler modelo ASTM E-11, Retsch, Haan, Germany). Las partículas con tamaños entre 250 y 500 μm fueron utilizadas para la extracción. Una muestra de 5 g fue macerada en mortero de porcelana empleando como disolvente etanol acuoso al 50% (relación sólido–líquido 1:5) a temperatura ambiente. El extracto crudo fue filtrado en papel Whatman N°1, luego fue concentrado en un rotavapor (Büchi R-3000, Flawil, Switzerland) a 35°C y posteriormente liofilizado (Uniequip, Unicryo MC4L-60, Martinsried, Germany). Para la evaluación de polifenoles totales y actividad antimicrobiana se prepararon concentraciones del extracto resuspendido en etanol acuoso al 50%.
Extracción líquido–líquido
El extracto crudo de hoja de murta fue sometido a extracción líquido–líquido de acuerdo a Torres y Bobet (2001). Un gramo de extracto crudo liofilizado (C) se desgrasó con éter de petróleo (3 veces × 10 mL). El residuo desgrasado se secó y resuspendió en agua acidificada (10 mL) con ácido acético (50 μL), los componentes monoméricos y oligoméricos se extrajeron con acetato de etilo (5 veces × 2,5 mL). Luego se obtuvo un extracto orgánico-acuoso (OA) y un extracto acuoso (A) que fueron concentrados en rotavapor y liofilizados. Para la evaluación de polifenoles totales y actividad antimicrobiana se prepararon concentraciones de los extractos A y OA resuspendidos en etanol acuoso al 50%.
Rendimiento de extracción (% de sólidos solubles totales). Un volumen conocido de extracto se agregó a un matraz previamente tarado, se evaporó en rotavapor, se secó en estufa y se pesó. El rendimiento de extracción expresado como % de sólidos solubles totales, fue calculado de acuerdo a la Ecuación 1.
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M 2 = masa balón tarado
-
M 1 = masa inicial de muestra (hojas de murta o extracto crudo liofilizado)
-
M 3 = masa balón + extracto (extracto C, A, OA)
Polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales fue medido mediante el método Folin-Ciocalteu descrito por Pinelo, Rubilar, Jerez, Sineiro y Nuñez (2005). Un mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido diez veces se mezcló con 0,8 mL de carbonato de sodio al 7,5% y 0,2 mL del extracto (C, A, OA y fracciones). La absorbancia fue medida luego de calentar la mezcla por 15 minutos a 45°C. Se utilizó un blanco sustituyendo el extracto por el disolvente empleado en la preparación del extracto. El contenido de polifenoles totales fue expresado como miligramos de ácido gálico equivalente (GAE). El rendimiento en polifenoles fue referido a la muestra liofilizada.
Separación del extracto OA en columna Sephadex LH-20
Cinco mL de extracto OA equivalente a 39,000 ppm GAE fue aplicado a una columna Sephadex LH-20 de 50 × 2,5 cm d.i. 50 g de Sephadex LH-20 fue suspendido en metanol acuoso al 50%, éste fue hidratado por 24 horas antes de ser empacado manualmente mediante la elución del mismo disolvente. La columna fue eluída con la secuencia de disolvente y flujo que muestra la , el porcentaje de metanol en la fase móvil fue aumentada cada siete horas de elución. Las muestras fueron colectadas cada 2 min en un colector de fraccione (BIORAD, 2110, Hercules CA, USA) y sus absorbancias fueron medidas a 280 nm (Espectrofotómetro Thermo, Genesis 6, Madison WI, USA). Las fracciones fueron colectadas, evaporadas bajo vacío para remover el disolvente orgánico y resuspendidas en etanol acuoso 50% (5 mL). La columna fue lavada con acetona al 70% (v/v) considerándose ésta como una última fracción.
Tabla 1. Forma codificado/no codifirada de las variables independientes utilizadas en el diseño factorial completo.
Table 1. Coded/non-coded form of the independent variables used in the full factorial design.
Análisis high performance liquid chromatography (HPLC)
Los extractos fueron analizados como describen Rubilar et al. (Citation2006). Cada muestra fue filtrada a través de un filtro de 0,45 μm e inyectada (20 μL) en el HPLC-arreglo de diodos (DAD) (Jasco, MD-2010 Plus, Hachioji, Japan). Se empleó una columna C18 (250 mm × 4,6 mm, tamaño de partícula 5 μm, Merck). El flujo fue de 0,7 mL/min. Los disolventes usados fueron metanol grado HPLC (A) y 0,5% de ácido acético en agua (B). El gradiente lineal de elución fue el siguiente: 0–10 min, 95A/5B; 10–60 min, 50A/50B; 60–80 min, 30A/70B; y 80–90 min, 95A/5B. La detección se realizó a 280 nm. El equipo utilizado para espectrometría de masas mediante electrospray, en campo positivo, fue un HP Agilent 1100 MSD, California, USA. Las condiciones fueron: flujo de gas de secado: 13 L/min, presión del nebulizador: 40 psig, temperatura del gas: 350°C y voltaje del fragmentador 60 V. Los espectros fueron analizados mediante el software HP Agilent, ChemStation, California, USA.
Análisis thin layer chromatography (TLC)
La cromatografía de capa fina para las fracciones fue realizada de acuerdo a Jerez et al., (Citation2007). En una placa de sílica gel 60 F254 de 20 × 20 cm se inyectó 40 μL de muestra a un centímetro de la base de la placa. La fase móvil empleada fue tolueno-acetona-ácido fórmico (3:6:1 v/v/v) que se dejó en la cámara por 30 min para su equilibrio con los vapores interiores. Luego la placa se introdujo dentro de la cámara hasta que el disolvente alcanzó una altura de 18 cm sobre la base. Los componentes separados fueron visualizados en primera instancia bajo luz UV a 365 nm. Luego fueron revelados mediante la aspersión de vainillina al 5% disuelta en etanol y acidificada con HCl al 10%. Posteriormente la placa se secó con aire caliente y los compuestos de tipo flavan-3-ol fueron visualizados como puntos de coloración rojiza.
Actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana de los extractos C, A, OA y fracciones separadas por columna Sephadex LH-20 fue evaluada frente a S. aureus ATCC25923 de acuerdo a metodología propuesta por Yesil, Hames, Bedir y Vardar (2007) con algunas modificaciones. La bacteria fue crecida a 37°C en caldo tripticasa de soja. Luego las células (50 μL, 106 UFC/mL) fueron inoculadas en la superficie de agar tripticasa de soja. Discos de papel filtro estériles (5 mm de diámetro), saturados con distintas concentraciones de extracto (esterilizado por filtración de 0,2 μm) en un rango de 0–0,5 mg de ácido gálico equivalente por disco, fueron ubicados en la superficie de cada placa inoculada. Las placas se incubaron durante 16 horas a 37°C. La actividad antimicrobiana se determinó por medición del radio de inhibición alrededor de cada disco de papel. Se realizó un control con el mismo disolvente de extracción. La zona de inhibición producida por los extractos vegetales fue comparada con un antibiótico comercial estándar Penicilina G 10 UI (Oxoid, Hampshire, UK). Finalmente los resultados fueron expresados como IC30 para los extractos C, A y OA e IC25 para las fracciones.
Diseño experimental
Un diseño experimental factorial compuesto 32 (Gacula & Singh, Citation1984) fue desarrollado para evaluar la influencia de las variables flujo y gradiente de elución de la fase móvil en el fraccionamiento de extracto OA de hojas de murta. Los valores de flujo fueron 2, 2,5 y 3 mL/min y el gradiente de elución binario, empleando disolvente A: agua y B: metanol, fue en escalón ascendente en % de B cada siete horas, (35–45–55%B; 40–50–60%B; 45–55–65%B). Las variables fueron codificadas de forma que sus valores oscilaron entre + 1 y −1, donde el valor 0 es el punto central. La muestra las variables en ambas formas codificados/no codificados. Los datos se ajustaron a una superficie de respuesta de Y que muestra la Ecuación 2.
Análisis estadístico
Todas las determinaciones se llevaron a cabo al menos por triplicado y a los valores promedio se les calculó la desviación estándar (±SD).
Las variables significativas fueron calculadas sometiendo los resultados a una regresión múltiple empleando el programa estadístico Design Expert (Versión 6.0, Stat-Easy Inc., Minneapolis, USA y Microsoft® Office Excel 2003). Sólo las variables con un nivel de confianza superior al 95% (p < 0,05) fueron consideradas significativas.
Resultados y discusiones
Humedad y rendimiento de extracción de hojas de murta
Las hojas de murta secas fueron caracterizadas respecto de su contenido de humedad remanente y rendimiento de extracción. Las condiciones de extracción empleadas fueron las informadas por Shene et al. (Citation2009), donde el empleo de etanol acuoso al 50% como agente extractor proporciona extractos de murta que ejercen la más alta actividad antioxidante y antimicrobiana.
Los resultados de humedad y rendimiento de extracción como porcentaje de sólidos solubles totales son presentados en la .
Tabla 2. Humedad y porcentaje de sólidos solubles totales de hojas de murta.
Table 2. Percentage of humidity and total soluble solids of murta leaves.
El valor obtenido de rendimiento de sólidos solubles totales en hojas de murta, 10,8%, resultó cercano al 9,6% obtenido por Shene et al. (Citation2009) para esta misma materia prima. En otras matrices vegetales se informan valores del orden del 7,7% para extracto de hojas de Andrographis (Subramanian, Asmawi, & Sadikun, Citation2008), 17,6% para extracto de Commelia communis L. (Youn, Park, & Cho, Citation2004) y 14% para Ficus microcarpa (laurel de indias) (Ao, Li, Elzaawely, Xuan, & Tawata, Citation2008).
Extracción líquido–líquido
Rendimiento de sólidos totales, polifenoles totales y actividad antibacteriana
El extracto crudo de hojas de murta (C) fue sometido a separación líquido-líquido, para obtener un extracto A y un extracto OA. Se evaluó el rendimiento de separación en función del porcentaje de sólidos totales presentes en cada extracto. El mayor rendimiento a partir de 1 g de extracto crudo liofilizado de hoja de murta, fue obtenido en el extracto A con un 81,70% de sólidos totales. En tanto, el extracto OA alcanzó un rendimiento del 5,28% (ver ).
Tabla 3. Porcentaje de sólidos solubles totales en extracto acuoso (A) y orgánico-acuoso (OA) de hoja de murta.
Table 3. Percentage of total soluble solids in aqueous extracts (A) and organic-aqueous (OA) of murta leaves.
En la , se presentan los resultados de polifenoles totales, actividad antimicrobiana frente a S. aureus y porcentaje de polifenoles totales en cada uno de los extractos C, A y OA. Los polifenoles totales fueron expresados como miligramos de ácido gálico equivalente (GAE) por gramo de extracto liofilizado, y la actividad antimicrobiana como IC30, que corresponde a la concentración de extracto medida como miligramos equivalentes de ácido gálico (GAE) que producen un 30% de la inhibición que generan 10 UI de penicilina.
Tabla 4. Polifenoles totales y actividad inhibitoria de Staphylococcus aureus de extracto crudo (C), acuoso (A) y orgánico-acuoso (OA).
Table 4. Total polyphenols and inhibitory activity of crude (C), aqueous (A) and organic-aqueous extract (OA) against Staphylococcus aureus.
El extracto crudo de murta presentó un contenido de polifenoles totales de 634,6 ± 0,01 mg GAE por gramo de extracto liofilizado. Los rangos que muestran hojas de otras especies varían entre 186,5 a 277,8 mg GAE por g de extracto (Alev, Erdag, Calmaz, & Aktas, Citation2008; Zavala-Nigoa, Loarca-Piña, & García-Gasca, Citation2006). Se puede apreciar el importante contenido de polifenoles que presenta el extracto crudo de murta respecto de otras matrices vegetales. A su vez, del total de compuestos polifenólicos presentes en la hoja de murta, los polifenoles solubles en agua representan un 76,4% (extracto A) y los solubles en agua y acetato de etilo (extracto OA) alcanzan el 7,8%. Claramente el extracto A solubiliza el mayor contenido de polifenoles.
Por otra parte, al comparar las inhibiciones (IC30) de los extractos en la , se puede inferir que en el OA se encontrarían los compuestos con mayor poder inhibitorio frente a S. aureus. Del extracto OA sólo se requieren 0,320 mg GAE para alcanzar un 30% de la inhibición que generan 10 UI de penicilina, mientras que del extracto A se requieren 0,651 mg GAE. Dado que los extractos A y OA presentaron un IC30 menor que el extracto C (0,738 mg de GAE), los polifenoles obtenidos mediante la separación líquido-líquido serían más activos que cuando forman parte del extracto C. Además se puede establecer que la extracción líquido-líquido favorece la separación de compuestos con mayor actividad inhibitoria frente a S. aureus.
Según Torres y Bobet (2001), se espera que el extracto crudo contenga especies monoméricas, oligoméricas y estructuras poliméricas de flavan-3-oles y flavonoles glicosilados. La separación por disolventes generaría que el extracto A contenga compuestos poliméricos, polifenólicos de mayor tamaño como flavonoles glicosilados y taninos. Por otra parte el extracto OA estaría enriquecido con especies monoméricas y oligoméricas de flavan-3-ol y flavonoles solubles en ambos disolventes (agua y etilacetato). Estudios realizados por Rubilar, Pinelo, Shene, Sineiro y Nuñez (2007) a matrices vegetales como bagazo de uva y cáscaras de almendra muestran la tendencia de la separación selectiva común a ambos residuos de la agroindustria. Esto es, ácidos fenólicos, flavonoles glicosilados y monómeros de flavan-3-ol han sido identificados en el extracto OA, mientras que procianidinas se han identificado en el extracto A. Pazos, Alonso, Fernández-Bolaños, Torres y Medina (2006) trabajaron con extractos de uva y encontraron, entre los compuestos de la fracción OA, flavonoles monómeros, oligómeros simples y polimerizados con un peso molecular promedio de 552 g/mol.
Por tanto, los resultados muestran que los compuestos presentes en el extracto OA son los más activos en la inhibición frente a S. aureus. Es por ello que este extracto es seleccionado para realizar un proceso de separación cromatográfica en Sephadex LH-20. Pazos et al. (Citation2006) han informado que un fraccionamiento cromatográfico entrega fracciones con mayor actividad antioxidante que el extracto OA de bagazo de uva. Entonces, para el caso de la actividad antimicrobiana es probable que la separación cromatográfica modifique las respuestas de actividad en función de los grupos de polifenoles separados. Se debe considerar además que la composición polifenólica varía de una matriz vegetal a otra. Es por ello que cobra importancia la evaluación del extracto OA de hoja de murta y la identificación de los compuestos polifenólicos responsables de su actividad antimicrobiana.
Metodología de superficie respuesta (MSR) en la separación de compuestos polifenólicos
Con el objetivo de encontrar las condiciones que permiten separar la fracción de polifenoles responsable de la actividad antimicrobiana, se empleó MSR para evaluar el efecto de las variables: flujo (X1) y gradiente de elución del disolvente (X2) sobre la separación de polifenoles del extracto OA de hojas de murta mediante cromatografía en gel. Como función de respuesta se midió: polifenoles totales (Y1) y actividad antimicrobiana (Y2).
La muestra los cromatogramas de la separación de polifenoles obtenidos al someter el extracto OA a las condiciones planeadas en el diseño central compuesto 32, con 11 corridas experimentales. Las repeticiones correspondientes al punto central resultaron idénticas (no son presentadas en la figura). Para cada corrida experimental o punto de diseño, se analizaron seis fracciones separadas entre sí por los mínimos de señal alcanzada entre los picos gráficos. En cada uno de los cromatogramas de la se puede apreciar claramente que los picos cromatográficos se ven modificados al cambiar las condiciones de elución.
Figura 1. Cromatogramas obtenidos al fraccionar extracto orgánico-acuoso a través de las condiciones propuestas en el diseño de experimentos.
Figure 1. Chromatograms obtained by fractionating the organic-aqueous extract under conditions proposed in experiments design.
Al realizar la separación cromatográfica, la fracción 6 presentó actividad antimicrobiana frente a S. aureus. Por tanto, las funciones de respuesta fueron evaluadas para esta fracción en cada uno de los puntos del diseño planteados a través de MSR. La presenta la matriz de diseño y los valores experimentales y teóricos para las funciones de respuesta polifenoles totales (mg GAE), e IC25 (inhibición del 25% del S. aureus empleando penicilina como patrón).
Tabla 5. Funciones de respuestas polifenoles totales y actividad antimicrobiana para las variables independientes de separación flujo (X1) y % de metanol (X2).
Table 5. Responses of total polyphenols and antimicrobial activity for independent variables of separation, flux (X1) and percentage of methanol (X2).
El análisis de regresión múltiple de los datos experimentales entrega modelos que pueden predecir comportamientos de las respuestas. De esta forma, se realizó un análisis de varianza para determinar si el efecto de las variables resultó significativo en la separación cromatográfica en cada respuesta y en el modelo. La variable independiente X1 (flujo) así como su interacción con la variable gradiente de elución X2 no son contribuyentes al modelo de polifenoles totales (p ≥ 0,05) y sólo la variable X2 por sí sola tiende a influir sobre la respuesta, no siendo significativa. Respecto del modelo, un valor en la relación señal/ruido de 6,099, demuestra que el modelo es predictivo, y el coeficiente de determinación R2 de 0,5522 indica que el 55% del contenido polifenólico separado en la fracción 6 está determinado por las variables flujo y gradiente de elución, dejando un gran porcentaje bajo la acción de variables no consideradas en el diseño (ver ).
Tabla 6. Análisis de varianza para la fracción 6.
Table 6. Variance analysis of fraction 6.
En relación a la actividad antibacteriana, sólo la variable X1 (flujo) en su forma lineal y cuadrática influye sobre la respuesta (p ≤ 0,05), la variable gradiente de elución no resultó significativa. Límites más amplios en el porcentaje de metanol (escalones que incluyan 0% y 100% de metanol) podrían afectar la respuesta. Del análisis de varianza se puede concluir que el valor F = 5,34 implica que el modelo es significativo, existiendo sólo un 4,5% de probabilidad de que la falta de ajuste ocurra por factores no considerados en el diseño. Se observa que la variable X1 2 (flujo no lineal) es significativa dentro del modelo, lo anterior es corroborado por medio del coeficiente de determinación múltiple R2 = 0,8423, donde aproximadamente el 84% de la actividad antimicrobiana estaría influenciada por las variables flujo y gradiente de elución. La relación señal/ruido de 6,310 indica que el modelo es confiable y puede ser usado para predecir comportamientos ().
Por tanto, un flujo mínimo y bajo contenido de metanol en la fase móvil maximiza el contenido polifenólico de la fracción 6 descrito por la ecuación polinómica obtenida. En tanto, la muestra el gráfico de superficie que permite visualizar los efectos de los dos factores combinados en la respuesta de actividad antimicrobiana. Cuando se utiliza el flujo de 2,5 mL/min la respuesta IC25 es mínima para todos los gradientes empleados en el diseño. Un valor IC25 mínimo indica que se requiere una baja concentración de polifenoles expresados como GAE para inhibir el 25% equivalente al antibiótico penicilina, demostrando una mayor actividad frente a S. aureus en relación a valores IC25 superiores. A su vez, el mínimo descrito se alcanza cuando el gradiente de elución es mínimo (35–45–55% de metanol), que son las condiciones de separación del punto de diseño 7 (0,208 mg GAE).
Figura 2. Efecto del flujo y gradiente de elución sobre la actividad antimicrobiana frente a S. aureus.
Figure 2. Effect of flow and gradient of elution on the antimicrobial activity against S. aureus.
Identificación de compuestos polifenólicos
Extracto orgánico acuoso
El extracto OA se analizó mediante HPLC-MS. La muestra el cromatograma a 280 nm y la presenta la identificación de compuestos fenólicos. Se identificaron compuestos flavan-3-ol monoméricos y poliméricos, derivado de ácido gálico, quempferol glucósido o galactósido, quercetina y miricetina glucósidos o galactósidos, quercetina xilósido y ramnósido.
Figura 3. Cromatograma de extracto OA de hojas de murta.
Figure 3. Chromatogram of OA extract of murta leaves.
Tabla 7. Identificación de compuestos fenólicos en extracto OA de hojas de murta.
Table 7. Identification of phenolic compounds in OA extract of murta leaves.
Fracciones separadas por cromatografía en gel
De acuerdo a los valores experimentales del diseño para la fracción 6 (), el punto de diseño 5 presentó el mayor contenido de polifenoles totales, los que a su vez resultaron activos frente a S. aureus. Es por ello que se seleccionó este punto de diseño para estudiar mediante cromatografía líquida con arreglo de diodos (HPLC-DAD) el perfil polifenólico de las 6 fracciones obtenidas.
En la se muestran los cromatogramas HPLC-DAD de las seis fracciones separadas por cromatografía en gel para el punto de diseño 5. Se puede apreciar claramente que las fracciones presentan distinta composición polifenólica. Aquellos cromatogramas con una tendencia ascendente que muestran picos anchos indican la presencia de compuestos de alto peso molecular, principalmente compuestos fenólicos polimerizados complejos o unidos entre ellos a azúcares (Rubilar et al., Citation2006; Pinelo, Del Fabro, Manzocco, Núñez, & Nicoli, Citation2005) como es el caso de los cromatogramas de las fracciones 1 y 6 ( y 4(f)).
Figura 4. Cromatogramas HPLC-DAD de las fracciones separadas por cromatografía en gel.
Figure 4. Chromatograms HPLC-DAD of fractions separated by gel chromatography.
La resume los distintos compuestos separados en cada una de las fracciones. Las cinco primeras fracciones separadas por cromatografía en gel contienen compuestos de tipo flavan-3-ol y flavonoles. En cambio los picos cromatográficos de la fracción 6 corresponden a diversos compuestos de tipo flavan-3-ol.
Tabla 8. Compuestos fenólicos presentes en fracciones separadas por cromatografía en gel (numeración de picos en cromatogramas HPLC-DAD).
Table 8. Phenolic compounds present in fractions separated by gel chromatography (numeration of peaks in HPLC-DAD chromatograms).
Los espectros UV visibles de la fracción 6, muestran la gran diversidad de compuestos presentes. Es posible que esta fracción esté constituida tanto por compuestos muy pequeños que quedan retenidos por más tiempo en los poros del gel Sephadex, además de los compuestos de mayor tamaño que no lograron traspasar la porosidad del gel y sólo han podido eluir con acetona. Puede existir entonces una interacción entre los compuestos polifenólicos y el gel Sephadex LH-20, este gel al ser un dextrano hidroxipropilado y entrelazado por una red de polisacáridos, contiene múltiples terminaciones hidrófilas creando una interacción con las moléculas polifenólicas mediante puentes de hidrógeno. De la misma forma, compuestos fenólicos de bajo peso molecular, que están fuertemente retenidos en los poros del gel tendrían disponibles sustituyentes hidroxilos hacia fuera de la partícula de Sephadex para realizar el enlace puente de hidrógeno con las otras moléculas de polifenoles que se eluyen por la columna cromatográfica. Esta interacción es la que se vería afectada al modificar la polaridad del disolvente.
Con el método de cromatografía en capa fina (TLC) es posible separar procianidinas de bajo y alto peso molecular, las procianidinas de alto peso molecular se pueden revelar bajo luz UV como zonas oscuras. En contraste, al revelar la placa con vainillina en medio ácido, las procianidinas de bajo peso molecular toman una coloración rojiza (Jerez et al., Citation2007). En la se muestra la cromatografía en capa fina que fue realizada en las fracciones separadas mediante cromatografía en gel. Las fracciones 1 y 2, estarían libres de flavan-3-ol en sus formas de monómeros y derivados.
Figura 5. Cromatografía de capa fina: círculos, marcas reveladas con vainillin; rombos, marcas observadas bajo luz UV (365 nm).
Figure 5. Thin layer chromatography: circles, marks revealed with vanillin; lozenges, marks observed under UV light (365 nm).
La vainillina se une a los nucleófilos negativos de los carbonos 6 y 8 del anillo bencénico ‘A’ del tanino. La reacción entre el aldehído y el tanino se desarrolla en medio fuertemente ácido, produciendo una coloración rojiza de mayor intensidad mientras exista mayor presencia de monómeros (catequina y epicatequina). Mientras que ésta será de menor intensidad en presencia de flavan-3-ol dímeros (procianidinas) o polímeros. Las fracciones 1 y 2 presentaron polímeros de alto peso molecular de flavan-3-ol que son revelados bajo luz ultravioleta.
También es posible observar compuestos de alto peso molecular revelados con luz ultravioleta en la fracción 6. Estos compuestos son retenidos en la zona baja de la placa cromatográfica, mientras los de bajo peso se retienen en la zona superior de la placa.
Los puntos definidos (círculos) de las fracciones 3, 4 y 6 corresponden a procianidinas de bajo peso molecular. En el extracto C se evidencian compuestos que no avanzaron a través de la placa cromatográfica y se acumularon en el lugar de la inyección. Según Jerez et al. (Citation2007) este efecto se produce debido a compuestos de alto peso molecular, hidrofílicos.
Finalmente, los perfiles polifenólicos de la fracción 1 y 6 son similares, sin embargo la fracción 1 no presenta actividad antibacteriana. Luego en base a la información obtenida de las distintas técnicas cromatográficas aplicadas a las fracciones se podría establecer que la principal diferencia entre estas fracciones sería la presencia de compuestos de menor peso molecular presentes en la fracción 6. Estos compuestos serían los activos frente a S. aureus.
Conclusiones
La separación líquido-líquido favoreció la actividad antimicrobiana de extractos de hoja de murta, debido a que el extracto OA demostró un mayor poder inhibitorio frente a S. aureus superando la inhibición del extracto crudo.
En la separación cromatográfica en gel del extracto OA se lograron obtener seis fracciones de compuestos fenólicos. De ellas se destacó la fracción 6 por su contenido polifenólico y actividad antimicrobiana. Sin embargo, el fraccionamiento del extracto OA por cromatografía en gel no aumentó su actividad antibacteriana frente a S. aureus. Por tanto, se infiere una acción sinérgica de los compuestos polifenólicos presentes en el extracto OA.
Respecto del análisis de MSR se desprende que las condiciones de separación cromatográfica de flujo (2,5 mL/min) y fase móvil con menor contenido de metanol (escalón 35–45–55%) favorecieron la separación de la fracción más activa frente a S. aureus, fracción 6. La actividad antibacteriana de la fracción 6 se vio influenciada significativamente al cambiar las condiciones de separación cromatográfica siendo el flujo en su forma no lineal la variable más influyente.
En la fracción 1 y 6 las técnicas cromatográficas revelaron que existe la presencia de compuestos flavan-3-ol polimerizados ya que el cromatograma HPLC presenta una forma ascendente, esto fue confirmado por cromatografía en capa fina que evidenció compuestos de alto peso molecular que fueron revelados bajo luz UV. También por TLC en la fracción 6 se encontraron compuestos de bajo peso molecular que fueron revelados con vainillina. Luego, de acuerdo a la composición de las fracciones 1 y 6, se estima que la propiedad antibacteriana estaría explicada por los compuestos de menor peso molecular presentes en la fracción 6.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo financiero otorgado por Conicyt a través del proyecto de investigación Fondecyt 1060311 y al convenio de desempeño II; así como al personal técnico GAP 2009, Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera.
Related Research Data
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